绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

张丽萌，李闰婷，聂晓宁，陈龙欣，邢真真，刘爱菊，房晓欢，韩红叶，马润林*，田树军,3*

(1. 河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2. 郑州师范学院分子生物学实验室，河南 郑州 450000；3. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北 保定 071000)

随着养羊生产向集约化方向的快速发展，产羔性状作为养羊生产中的重要经济性状对养殖经济效益的影响巨大[1-2]。卵巢作为动物繁殖的重要生殖器官，直接影响胎产羔性能。本实验室对绵羊卵巢组织转录组的研究结果发现，FHL2(Four and a half LIM domains protein 2)在产单胎和产多胎的绵羊卵巢组织中的表达量差异显著，推测FHL2在绵羊繁殖机能调控发挥重要作用。FHL2属于LIM-Only蛋白家族中的一员，蛋白分子量为32 kD[3]，可以作为转录共激活子或转录共抑制子，与多种蛋白和因子互作，影响细胞的增殖分化、迁移、周期、凋亡以及激素分泌，还可以与信号因子结合参与基因表达的调控、信号传递通路等诸多过程[4-7]。然而，FHL2调控绵羊卵巢生殖机能的作用机制目前尚不清楚。

酵母双杂交技术是一种研究蛋白互作的方法，其主要是在建立宿主细胞酵母cDNA文库的基础上，构建包含特定基因的诱饵质粒，使其与文库杂交后，在选择性培养基上，筛选宿主细胞蛋白，能够与目的基因编码的蛋白发生相互作用。该技术不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，而且可以筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白[8]。酵母双杂交技术已经被广泛用于蛋白与宿主细胞的互作机制、蛋白质组学、细胞信号转导等众多生物学领域的研究[9-10]。利用酵母双杂交技术发现，在人内皮细胞和平滑肌细胞中，FHL2可以作为转录共抑制子与核受体Nur77互作[11]。对人和小鼠的研究则发现，FHL2作为转录协调因子，在卵泡发育中调控重要功能基因的表达[11-12]。可见，成功构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库，将成为探究FHL2调控绵羊卵巢繁殖机能的基本工具。

本研究以绵羊卵巢组织细胞的总RNA为模板，反转录合成cDNA，长链PCR(LD-PCR)扩增双链cDNA，与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187感受态细胞，通过SMART技术构建绵羊卵巢组织细胞cDNA文库，旨在为进一步研究FHL2与宿主细胞间的互作机制提供重要的研究工具，也将为提高绵羊繁殖性能和治疗卵巢疾病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本来源及主要试剂

绵羊卵巢组织样本为实验室采集的小尾寒羊卵泡期和黄体期的卵巢组织。TRIzol购自Invitrogen公司，Green Taq Mix聚合酶购自Vazyme公司，Trans2K plus DNA Marker购自北京全式金公司，SD/-Leu 酵母营养筛选培养基、Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System cDNA文库构建系统、CHROMA SPINTTM+TE-400 Columns 纯化柱、酵母菌质粒提取试剂盒、Aureobasidin A(Aba)、X-α-gal均购自Clontech公司；RNeasy Plus Mini Kit(50)试剂盒购自QIAGEN公司。

1.2 cDNA文库引物设计合成

根据质粒 pGADT7-Rec序列设计1对扩增文库插入片段的通用鉴定引物。引物序列如下：PF：5′-TA- ATACGACTCACTATAGGG-3′，PR：5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′。由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 绵羊卵巢组织总RNA 提取

按照RNeasy Plus Mini Kit试剂盒说明书提取绵羊卵巢组织的总RNA。微量紫外分光光度计NanoDrop 2000测定总RNA纯度及质量浓度，1%变性琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性。

1.4 cDNA第一链的合成

根据Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System cDNA文库构建系统说明书，取2μL总RNA于PCR管中，利用试剂盒中的CDSⅢ PCR Primer将总RNA反转录成cDNA第一链。

1.5 ds cDNA 扩增及纯化

利用长链 PCR(LD-PCR)将上述cDNA第一链反应物合成ds cDNA，反应体系按照试剂盒说明书进行操作，选择扩增22个循环。之后将LD-PCR产物用CHROMA SPINTTM+TE-400柱纯化。并分别取纯化前后的ds cDNA进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6制备Y187酵母感受态细胞

挑取30℃培养3 d的Y187酵母单菌落，接种于加入50 μg/mL卡那霉素(Kan)20 mL的YPDA液体培养基中，30 ℃振荡培养至OD600>1.5(约24 h)，取菌液接种至100 mL新的YPDA液体培养基中，使菌液OD600为0.2～0.3，继续培养至OD600为0.4～0.6。将100 mL菌液700×g离心5 min，用30 mL无菌ddH2O重悬菌体，700×g再次离心5 min，加入1.5 mL 1.1×TE/LiAC重悬菌体，12 000 r/min离心15 s，再用600 μL 1.1×TE/LiAC重悬菌体，此菌体即为Y187酵母感受态细胞。

1.7 绵羊卵巢组织酵母双杂交文库构建

将纯化后的ds cDNA 和pGADT7-Rec按比例共转化Y187酵母感受态细胞。转化产物用0.9% NaCl(W/V)重悬后，涂布于SD/-Leu筛选固体缺陷培养基，30 ℃培养3～5 d。收集文库：将平板在4 ℃冷却6 h，用无菌刮铲收集菌落，加入无菌的冻存液(含25%甘油的YPDA 液体培养基)，充分混匀后分装至无菌的1.5 mL 离心管，-80 ℃贮存备用。

1.8 文库插入片段鉴定

取共转化产物做102、104稀释，涂布于90 mm SD/-Leu平板上，30℃培养3～5 d，进行菌落计数，计算文库容量和滴度。计算公式：文库滴度=每板平均克隆数/涂布体积×稀释倍数；文库总容量(cfu)=平均滴度(cfu/mL)×cDNA文库总体积(mL)。在SD/-Leu培养平板上随机挑取23个单菌落，用pGADT7-Rec设计的通用测序引物进行菌落 PCR鉴定。反应体系：Green Taq Mix 12.5 μL，T7和3′AD引物(10 μmol/L)各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 15 min，72 ℃ 1min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，分析文库插入片段的大小以及重组率。

2 结果

2.1 绵羊卵巢组织细胞总RNA的提取

利用卵泡期和黄体期的卵巢组织提取总RNA，NanoDrop 2000测定总RNA 浓度为1 900 ng/μL，OD260/OD280为1.96。1%琼脂糖电泳后可看到清晰的28S、18S和5S 3条亮带，28S/18S ≈2/1，如图 1所示。说明提取的绵羊卵巢组织总RNA质量和纯度较高，满足构建文库的要求。

M. DNA分子量标准(Trans2K plus DNA Marker)；1. 总RNA样品图1 绵羊卵巢组织总RNA电泳结果

2.2 扩增及纯化ds cDNA

总RNA在引物作用下通过SMART MMLVRverseTranscriptase反转录酶作用下合成cDNA第一条链，利用LD-PCR扩增ds cDNA，并对产物进行纯化处理，同时以试剂盒提供的小鼠ds cDNA产物作为阳性对照，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，第一链cDNAs扩增后的PCR产物在泳道内弥散状分布，且纯化处理后条带在250～3 000 bp(见图2)，ds cDNA纯化后，较纯化前去除了小于400 bp的片段，主要集中在500～3 000 bp之间，并且在大约1 000～2 000 bp密集分布 (见图3)。以上结果表明，ds cDNA分布较为完整，适合用于cDNA文库构建。

2.3 文库建立及滴度测定

将纯化后的ds cDNA 和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞，涂板培养后获得绵羊卵巢组织酵母双杂交文库。取共转化的文库菌液进行102和104倍稀释，取50 μL涂于固体培养基上培养3～5 d，分别统计稀释102和104后长出的单克隆数目。所构建的cDNA 文库104平板菌落统计结果共长了约100个克隆。经计算，文库滴度为2×107cfu/mL。共计15 mL的转化后原始菌液，根据计算公式得出本次构建的cDNA文库容量为3×108cfu。

M.DNA分子量标准(Trans2K plus DNA Marker)；1. 绵羊卵巢组织细胞的ds cDNAs扩增；2. 阳性对照ds cDNAs扩增图2 绵羊卵巢组织细胞双链cDNA扩增

M.DNA分子量标准(Trans2K plus DNA Marker)；1. 纯化后的ds cDNA图3 纯化后ds cDNA

2.4 cDNA文库插入片段鉴定结果

从SD/-Leu 平板上随机挑取23个SD/-Leu单菌落进行PCR鉴定。图5的结果显示，扩增产物长度大小主要集中在500～2 000 bp，平均长度约为1 000 bp。23个克隆中仅有1个克隆扩增出多条非特异性条带，由此计算出文库重组率为96%(22/23)。上述结果表明，cDNA文库质量合格，可用于后续酵母双杂交试验。

M.DNA分子量标准(Trans2K plus DNA Marker)；1～23. 插入片段PCR 产物图5 PCR检测文库插入片段

3 讨论

蛋白质是基因功能的执行者，综合分析蛋白与蛋白之间的互作能够更加深入探究蛋白质的具体功能[13-14]。目前研究蛋白质互作，常用的是酵母双杂交技术，该技术可以直接在酵母细胞内检测蛋白质互作，可以从cDNA文库中筛选到多种与诱饵蛋白有相互作用的已知或未知蛋白，具有能检测到一些微弱的蛋白质互作，以及在酵母细胞内验证互作而无需纯化蛋白质等优点，成为目前筛选互作蛋白的主要方法[15]；缺点是假阳性高，需要在不同缺陷培养基中筛除大量的假阳性互作蛋白[16]。

构建一个质量合格的cDNA文库对于酵母双杂交筛选至关重要，这就与总RNA提取的纯度和完整性密切相关[17]。同时，在纯化ds cDNAs过程中，使用CHROMA SPINTM+TE-400 Columns纯化柱，对扩增后的cDNAs进行纯化，主要是为了排除小片段，避免其在后续试验中产生不必要的干扰[18]。鉴于此，本试验使用Make Your Own“Mate&PlateTM”Library System cDNA文库构建系统，利用SMART 技术和同源重组技术，高效地将纯化的ds cDNA和线性化的pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞，获得满足酵母双杂交筛选的绵羊卵巢组织细胞cDNA文库。

判断酵母双杂交cDNA文库质量好坏的关键因素是插入片段的大小和文库容量。统计结果显示，本试验所构建的酵母双杂交文库插入片段的平均长度约为1 000 bp，滴度为2×107cfu/mL，均符合SMART文库构建的要求。同时，研究结果显示，该酵母双杂交文库具有较好的cDNA片段多态性和完整性，可用于进一步的文库筛选。构建的cDNA文库的总库容量为3×108cfu，具有很高的重组率和随机性。cDNA文库的构建为进一步研究FHL2与宿主细胞的相互作用机制提供工具。

综上，本研究利用SMART技术成功构建了绵羊卵巢组织酵母双杂交cDNA文库。文库容量为3×108cfu，滴度为2×107cfu/mL，重组cDNA 片段大小主要集中在500～2 000 bp，重组率为96%。