鸡毒支原体(MG)疫苗株和野毒株的PCR鉴定

李玉燕，李贵阳，沈巍，巩新民,祝永华，张霞,沈霞，王传堂，张承新，刘晓阳，郭龙宗*

(1. 山东益生畜牧兽医科学研究院，山东 烟台 250000；2. 青岛英赛特生物科技有限公司，山东 烟台 250000 )

支原体感染是鸡群中普遍存在的一种感染，在大型养殖公司的集约化饲养的鸡群，支原体感染尤为严重。对鸡群有明显致病性的支原体主要有二种，即滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae, MS)和鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)[1]。MG是致病性最强、引起经济损失最大的家禽支原体病原[2]。临床以胸、腹气囊炎病变为主，可引起商品代雏鸡死淘率增高、料重比增加和蛋鸡产蛋数减少，且常与其他呼吸道病原混合感染，造成更大经济损失。我国在 20 世纪60 年代开展对此病的研究，20 世纪90年代的调查显示，我国鸡群 MG 阳性感染率为 50%～80%[3]。该病可垂直和水平传播，其中种鸡的垂直传播会给下游企业带来持续不断的感染，造成巨大经济损失，在行业内引起广泛重视，也是可净化的一种重要垂直传播性疾病，该病在发达国家已经实现净化，而国内该病的感染还十分严重。

控制支原体疾病一般采用活疫苗或活疫苗+灭活苗结合免疫，应用较为广泛的活疫苗菌株有F株、6/85株、TS-11等，而环境中支原体感染性强毒株有R株、S株等。TS-11、F株MG疫苗株可在鸡的上呼吸道终生携带，并会干扰临床样品PCR的检测结果，因此，无法通过简单的PCR方法评估鸡群中支原体的控制和净化状况。另外，在疫苗的应用过程中其回复突变导致一定的毒力，基于弱毒活疫苗的有效性及安全性考虑，建立有效鉴别不同MG疫苗株和野毒株的方法十分重要。本研究对临床免疫MG活疫苗(6/85、TS-11)的鸡群，采集咽喉拭子和毛蛋气囊拭子、气管、肺等疑似支原体感染样品进行MG的PCR检测，建立了MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)与野毒株(S株、R株)的PCR鉴定方法，并对临床检测数据进行汇总分析，以期对MG的防控与净化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PCR引物由青岛英赛特生物科技有限公司设计与合成，核酸提取试剂盒购自青岛英赛特生物科技有限公司。PCR反应试剂盒、琼脂糖、TAE均购自北京全式金生物技术有限公司。 MG TS-11和F疫苗株(批号为MGS 170911A)作为TS-11阳性对照，购自澳大利亚生物资源；MG 6/85疫苗株(批号为02408208)，购自默沙东(中国)有限公司(MSD)，野毒株S6和R株阳性对照由南京天邦生物科技有限公司惠赠。

1.2 试验设计

设计针对MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)与野毒株(S6株、R株)的引物，对临床免疫MG活疫苗TS-11的种鸡群(A～I场)的后代啄壳死亡的毛蛋气囊拭子、临床送检免疫6/85的鸡群(J场)的气管、肺、腹膜等疑似支原体感染样品采用MG通用引物进行PCR鉴定，对阳性DNA再分别用TS-11、F株、6/85、S6株、R株的特异性引物进行鉴别诊断。种鸡群TS-11在5周龄进行滴眼方式免疫，种鸡群6/85疫苗株在7周龄进行喷雾方式免疫。对A场父母代后代死亡啄壳毛蛋持续存在气囊炎的种鸡群，同时采集咽喉拭子进行MG的检测，分析种鸡群与后代鸡群的MG流行感染状态。采集山东益吉达SPF鸡群咽喉拭子作为阴性对照组。最后对临床采集样品MG的PCR检测数据进行汇总统计分析。

1.3 样品的采集与处理

咽喉拭子样品的采集：将棉棒插入喉头口及上颚裂处来回刮3～5次取咽喉分泌液，将样品端插入离心管剪下或折断，放入含有0.8～1.0 mL PBS的离心管中，备用。

气囊拭子样品的采集：将灭菌棉签插入雏鸡或毛蛋气囊内侧，来回刮3～5次，将样品端插入离心管，棉签剪下或折断，放入含有0.8～1.0 mL PBS的离心管中，备用。

分别采集病鸡的肺脏、气管、腹膜，加入2倍灭菌生理盐水研磨，直至成为匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇震后，4 ℃，12 000 r/min离心5 min。取上清用0.22 μm滤器过滤，备用。

父母代和祖代鸡群支原体病原监测周龄为1、4、11、13、16、21、26、30、34、40、46、52及58周，每舍采集30对咽喉拭子。

祖代和父母代种鸡群开产后，在30、32、34、37、40、43、46、49、52、55及58周检测20～30枚啄壳死亡毛蛋，观察气囊是否浑浊，进行气囊评估，同时采集气囊拭子进行MG的PCR检测。

毛蛋气囊拭子DNA提取参照青岛英赛特生物科技有限公司开发的咽喉拭子基因组DNA提取试剂盒的使用说明，从咽喉拭子和气囊棉拭子挤出并离心的上清液提取DNA。

1.4 PCR引物

参照赵杰等[4]筛选出的针对MG序列的套式PCR引物，作为检测MG的通用引物，由青岛英赛特生物科技有限公司合成，扩增片段为300 bp。MG疫苗株(TS-11、F、6/85)与野毒株(S6、R)的引物由青岛英赛特生物科技有限公司设计合成，引物序列为：MG-TS11-F：GGTAAAAATCAATACAGTGTT-TTTC，MG-TS11-R:TGGACTCATATTTCTTTCTTTTGC；MG-F-F：ATCATTCTAAATGCTTCTCAACG,MG-F-R: TCTAATAGATCCGTTTGAGG；MG-6/85-F:TTTTATCCAGTAGTGGGTGC，MG-6/85-R: TGTGGTCTGAAACCTGCTCTTGGTTG；MG-S6-F: ACTCCTCGTCCATTCATTGCTAT， MG-S6-R: TCCCGATGTAATCGATAATCAAG；MG-R-F: AGGTCATACTTACGCTTGGAAAC，MG-R-R: TCGATAGAGTTAATTGACTATGAAAAG。MG疫苗株TS-11的目的片段为600 bp、MG疫苗株F株的目的片段为347 bp、MG疫苗株6/85的目的片段为500 bp、野毒株S6株的目的片段为310 bp、野毒株R株的目的片段为324 bp。

1.5 目的基因片段的扩增

第1对引物反应体系为25 μL。2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL，提取的DNA模板3 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环，72 ℃延伸10 min。

第2对引物套式PCR反应体系同第1对引物，模板为第1次PCR扩增产物(3 μL)。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。

MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)与野毒株(S6株、R株)的引物反应体系同MG套式PCR第1对引物反应体系。PCR反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。

反应结束，取7 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，于紫外光线下观察并记录结果。

2 结果

2.1 免疫MG疫苗株6/85的鸡群MG-PCR检测

7周龄免疫MG疫苗株6/85的鸡群于10周龄送检5只存在气囊炎病变的鸡只，采集气管、肺、气囊拭子、腹膜等样品进行MG的PCR检测，MG通用引物套式PCR检测均为阳性(见图1)，该引物已在文献[1]中验证。MG疫苗株6/85 PCR检测均为阳性(见图2)，MG野毒株S6的PCR检测均为阳性，R引物的PCR检测为阴性(见图3)。这表明，该鸡群在免疫后1个月左右仍能检出MG 6/85疫苗株，同时存在MG野毒株S6的共感染。

M. DNA 2000 Marker；1～5.客户鸡群采集样品；6. 阴性对照图1 免疫MG疫苗株6/85的鸡群(J场)样品MG套式PCR产物

M. DNA 2000 Marker；+. MG疫苗株6/85；-.阴性对照；1～5. 客户鸡群采集样品图2 免疫MG疫苗株6/85的鸡群(J场)样品MG疫苗株6/85引物扩增产物

M. DNA 2000 Marker；1-5. 客户鸡群采集样品图3 免疫MG疫苗株6/85的客户鸡群(J场)样品MG野毒S6和R株引物扩增产物

2.2 免疫MG疫苗株TS-11的鸡群(F场)后代啄壳死亡毛蛋的气囊拭子的 MG-PCR 检测

免疫MG疫苗株TS-11的鸡群(F场)送检后代啄壳死亡的毛蛋，采集气囊拭子进行MG的PCR检测，通用引物套式PCR检测均为阳性，MG野毒株S6和R株的PCR检测均为阳性(见图4、图5)。这表明，该鸡群后代同时存在MG野毒株S6和R株的共感染。

M.DNA 2000 Marker；1-4. 鸡群(F场)采集后代啄壳死亡毛蛋气囊拭子样品图4 免疫MG疫苗株TS-11的鸡群(F场)啄壳死亡的毛蛋气囊拭子S6引物扩增产物

图5 免疫MG疫苗株TS-11的鸡群(F场)啄壳死亡的毛蛋气囊拭子R引物扩增产物

2.3 MG疫苗株F株的MG-PCR检测

采用MG疫苗株F株验证检测方法针对F株引物的特异性，结果显示MG通用引物套式PCR检测均为阳性，MG疫苗株F株均为阳性，TS-11、6/85、S6、R株均为阴性(见图6)。这表明，设计的F株引物针对MG疫苗株F株的特异性强。

M. DNA 2000 Marker；1-2. F株疫苗株图6 F株疫苗株各MG鉴别引物F株、TS-11、6/85、S6、R株 PCR产物电泳

2.4 SPF鸡群采集咽喉拭子的MG-PCR 检测

采集山东益吉达SPF鸡群132份咽喉拭子进行MG的PCR检测，结果显示，MG通用引物套式PCR检测均为阴性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均为阴性。表明该MG鉴别引物特异性强。

2.5 免疫MG疫苗株TS-11父母代种鸡群(A～H场)和祖代种鸡群(I场)后代啄壳的毛蛋气囊拭子的MG-PCR检测

祖代种鸡群(I场)后代啄壳的447份毛蛋气囊均无浑浊，气囊拭子进行MG-PCR检测，结果显示，通用引物套式PCR检测均为阴性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均为阴性(见表1、表2)。同时祖代种鸡群(I场)咽喉拭子的MG检测也均为阴性。对A～H场父母代种鸡群啄壳的毛蛋浑浊气囊拭子，进行MG-PCR检测，结果见表2。

MG-套式PCR通用引物检测均为阳性；A场和D场浑浊气囊拭子中野毒S6的PCR阳性率均为100%；B场父母代浑浊气囊拭子中野毒S6和R株的PCR阳性率均为80%，S6 株PCR可疑率20%；C场父母代浑浊气囊拭子中野毒S6和R株的PCR阳性率分别为25%、75%，S6 株PCR可疑率75%；E场父母代浑浊气囊拭子中只检出TS-11，其余均为阴性；F场和H场浑浊气囊拭子中野毒S6和R株的PCR阳性率均为100%；G场浑浊气囊拭子中野毒S6和R株的PCR阳性率均为100%。不同父母代鸡群后代啄壳的毛蛋浑浊气囊阳性率有差别，H场父母代阳性率最低，为1.13%；F场父母代的阳性率最高，达16.89%(见表1)。

表1 父母代种鸡和祖代种鸡群后代啄壳毛蛋浑浊气囊阳性率

2.6 A场父母代种鸡群咽喉拭子和后代啄壳的毛蛋气囊拭子MG-PCR检测

A场父母代种鸡群后代啄壳的毛蛋气囊从50周龄开始出现病变，后期一直持续存在(见表3)。采集的浑浊气囊拭子经MG鉴别引物PCR检测，可同时检出野毒S6(见表2)。同时对A场父母代种鸡群采集咽喉拭子，经MG鉴别引物PCR检测，也可检出野毒S6。表明种鸡群感染MG，可垂直传播给后代。

表3 A场父母代各周龄后代啄壳毛蛋气囊评估检测结果统计

3 讨论

在规模化养殖的鸡群中，支原体感染是非常普遍的现象，特别是对鸡致病性高的MG在鸡群内很容易通过呼吸道造成横向传播。此外，MG还能通过鸡胚从种鸡垂直传播给后代，给下一代造成显著放大的感染率[1]。目前控制MG的措施包括种群净化、疫苗接种和药物治疗[3]。发达国家通过良好的生物安全措施，已经净化和控制了MG。山东益生种畜禽股份有限公司首次引进的哈伯德(HBD)曾祖代通过疫苗免疫和严格的生物安全措施，进行一个完整的饲养周期的持续观察和检测，真正实现了无MG和MS感染。这表明，在我国是完全可以通过生物安全来有效控制MG。通过抗体和病原体检测证明，该公司可作为我国大型种鸡场实现无MG和MS感染的成功示范[1]。本公司已经把曾祖代鸡群的成果示范的经验推广向了祖代，通过对I场祖代鸡群的MG持续跟踪检测，在采集的种鸡群的咽喉拭子和后代啄壳的毛蛋气囊拭子样品中，PCR均未检测到MG病原。

MG的活疫苗研究始于20世纪70年代，目前应用的MG的活疫苗毒株包括TS-11、6/85和F株等，国内使用的活疫苗为MG康涅狄克F株疫苗，我国也有MG活苗F36株。F株是应用时间最长和最广泛的疫苗，能明显提高患病鸡的产蛋量。近年来人们发现其具有引发感染的潜在威胁，F株免疫没有取代其他毒株反而感染了未接种鸡群，并可经蛋传播给子代鸡[5]。MG 疫苗株TS-11是由澳大利亚田间分离株80083株经化学诱变和温度敏感(33 ℃)筛选方式研制的疫苗，具有毒性小、不易传播的特点。对49日龄鸡的疫苗安全性进行了评价，发现TS-11菌株在体重、病变和临床表现方面均具有良好安全性[6]。MG 6/85 株是由美国研发的疫苗，主要用于预防蛋鸡产蛋下降，对产蛋率、蛋重和蛋壳强度影响不大，是目前比较安全的活疫苗[7]。目前我国市售活疫苗菌株主要是F36株，TS-11和6/85弱毒制作的疫苗比F株毒力更弱，对鸡和火鸡均无毒力，疫苗对未受MG感染的鸡有较好的免疫效果，也可用于火鸡的免疫接种[8]。因此，近年来TS-11株和MG 6/85株更多的被作为商品化弱毒苗用于鸡和火鸡。试验证明，用 TS-11、6/85 两种疫苗接种的鸡群，主要是细胞免疫起重要作用，虽然也能产生保护作用，但血清中检测不到抗体，不易判断免疫效果[3]。另外，TS-11、F株疫苗株可在鸡的上呼吸道终生携带，常规方法不易区分。

本研究建立的方法可有效区分MG疫苗毒(TS-11、6/85、F株)和野毒(S6、R株)，通过采集SPF鸡群进行MG鉴别引物的PCR结果显示，该鉴别引物特异性强，不存在假阳性的弊端。MG 6/85疫苗株一般在呼吸道中存在一个月左右，本研究对7周龄免疫6/85的鸡群，在10周龄采集气囊炎病变的样品进行MG鉴别引物的PCR结果显示，MG 6/85疫苗株检测均为阳性，但该鸡群也同时存在S6的野毒感染。通过采集免疫TS-11疫苗株(A～H场)鸡群后代啄壳的毛蛋进行观察，气囊浑浊毛蛋的阳性率存在极大的差别，H场父母代阳性率最低，为1.13%，而F场父母代的MG阳性率高达16.89%。在相同的免疫程序下，这种差别与每个场区的生物安全管理紧密相关。郭龙宗等[1]论述了生物安全对净化MS和MG支原体的重要性，这一点在饲养规模较大的父母代场区中的作用尤为重要。同时采集免疫TS-11疫苗株鸡群的后代啄壳毛蛋气囊拭子进行MG鉴别PCR 的检测，结果显示：浑浊气囊拭子中野毒株S6和R株的阳性率的比例较高，部分场区可同时检出这两种野毒。通过对A场父母代种鸡群采集咽喉拭子和后代啄壳毛蛋气囊拭子进行MG鉴别引物PCR检测，结果表明种鸡群MG的感染，可通过垂直传播感染其后代。

综上，本试验建立的MG疫苗株和野毒株的PCR鉴别方法，可快速鉴别出临床样品的MG 疫苗株和野毒株，尽早发现MG野毒感染鸡群，对MG 发病鸡群尽快采取防治措施，最终为净化MG 提供实际应用价值。