四环素和锑复合污染对底栖生物酶活性的影响

何香廷，杨再福，张琪悦，侯振宇

(东华大学环境科学与工程学院，上海 201620)

重金属和抗生素是当今世界最为严重的污染物。中国是Sb储备量和使用量最高的国家[1]，也是抗生素生产和使用的第一大国[2]。人们对汞、铬、铅等重金属的研究颇多，对重金属锑的报道较少。近年来印染行业等工业生产排放的大量Sb导致了多次污染事故[3]，使土壤、水、大气中的锑浓度显著增加，如太浦河流域饮用水和广元锑污染事件等。同时，具有杀菌消毒作用的四环素已经被广泛应用于农业生产、畜禽养殖等行业[4]。由于抗生素类不易吸收，所以动物体摄入的大部分抗生素以原药或其代谢产物形式排出体外，导致耐药性和抗性基因的污染[5]。近几年有研究表明，土壤、地表水、底泥中等均已检测到了抗生素的存在[6-8],给生存环境和人类健康带来了严重危害，但有关锑和四环素的联合研究未见报道。

本实验选取四环素和锑作为目标化合物，分析两种目标化合物对中华圆田螺肝胰脏酶活性的单一及联合影响，为水环境中四环素和Sb对底栖生物的生态风险评价提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用中华圆田螺为受试生物。选用大小均匀、行动活泼、反应灵敏的健康田螺，质量为(3.28±0.05)g。田螺经5%食盐水消毒后进入实验室，在2L的大烧杯中驯养5d后进行实验。

1.2 仪器与试剂

仪器：Spectrumlab752S紫外分光光度计(上海棱光)；FSH-2A组织匀浆机(上海旌派)；SC-3612低速离心机(北京格瑞恩)。

试剂：盐酸四环素(Signa-Ardrich Co.LLC, USA)，蛋白质定量测试试剂盒，CAT试剂盒，GSH试剂盒(试剂盒均来自南京建成生物工程研究所)。

1.3 实验方法

1.3.1 田螺急性毒性试验

四环素单一毒性试验：将中华圆田螺暴露于5个不同的浓度梯度(0、1、10、100、500mg/L)，并设置3组平行实验。每只2L的烧杯中放入10只大小均匀、行动活泼的田螺，进行96h急性毒性试验并获得四环素对田螺的半致死浓度(LC50四环素)。

锑单一毒性试验：将中华圆田螺暴露于8个不同的浓度梯度(0、8、12、18、24、32、64、128mg/L)，并设置3组平行实验。每只2L的烧杯中放入10只大小均匀、行动活泼的田螺，进行96h急性毒性试验并获得四环素对田螺的半致死浓度(LC50锑)。

四环素和锑联合急性毒性试验：将中华圆田螺暴露于9个不同的浓度梯度，其中四环素和锑的浓度为(0、12.5+3.38、25.0+6.75、50.0+13.50、100.0+27.00、150.0+40.50、200.0+54.00、300.0+81.00、400.0+108.00mg/L)，并设置3组平行实验。每只2L的烧杯中放入10只大小均匀、行动活泼的田螺，进行96h急性毒性试验并获得四环素和锑联合对田螺的半致死浓度(LC50联合)。

1.3.2 培养及实验条件

进行目标化合物对田螺体内蛋白质的影响、目标化合物对田螺肝胰脏GSH活性的影响、目标化合物对田螺肝胰脏CAT活性的影响3组实验，培养168h。设置的浓度梯度为0%、10%、40%、70%、90% LC50四环素，0%、10%、40%、70%、90% LC50锑和0%、10%、40%、70% LC50联合。实验开始时，每个培养缸放入10只大小均匀、行动活泼的田螺；实验开始后，每个培养缸于24h、72h、168h分别随机抽取2只田螺进行后续实验。

1.3.3 蛋白质、GSH、CAT样本制备

准确称取各浓度组待测田螺的重量。按照质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下用组织匀浆机研磨均匀，冷冻离心机4℃、4500rpm条件下离心10min后，取上清液用生理盐水按1∶9比例稀释成1%浓度组织匀浆，待测。

1.3.4 测定方法

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；采用紫外分光光度法测定GSH和CAT的活性，具体测定操作和计算按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。GSH和CAT活性分别以mgGSH/gprot、U/mgprot活力单位表示。

1.4 统计分析

采用Origin8.0软件对实验进行作图，SPSS22.0统计软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 田螺急性毒性试验结果

四环素单一毒性试验：田螺在72h时有明显死亡迹象，根据田螺的死亡数采用SPSS22.0处理数据得知四环素的LC50 =100mg/L。

锑单一毒性试验：田螺在48h时表现出行动迟缓等轻微中毒迹象；96h时田螺缩回壳内，几乎无行动力，根据田螺的死亡数采用SPSS22.0处理数据得知Sb的LC50 =27mg/L。

四环素和锑联合急性毒性试验：暴露条件为四环素+Sb(100mg/L+27mg/L)的田螺在72h及96h时肌肉松软，部分田螺因中毒而亡，根据田螺的死亡数采用SPSS22.0处理数据得知联合四环素的LC50 =93.53mg/L、联合Sb的LC50 =25.25mg/L。

表1 卡方测试

由此可知，四环素和锑的联合效应为轻微的拮抗作用。

根据急性毒性试验的结果设置各实验组目标化合物的浓度见表2。

表2 实验组目标化合物的浓度

2.2 目标化合物对田螺体内蛋白质的影响

图1显示了田螺体内的蛋白质含量随着时间及暴露条件的变化。由图可知，随着时间的增加，在不同浓度的四环素、Sb以及四环素和Sb联合条件下暴露的田螺体内的蛋白质含量均呈现出先增加后减少的趋势，在实验结束即168h时测定的田螺体内蛋白质含量低于对照组田螺体内的蛋白质含量。由此可知，无论在四环素暴露条件下，还是重金属Sb暴露条件下，最终均会使田螺体内的蛋白质含量降低。王雅慧[9]等研究发现在大菱鲆幼鱼的饲料中添加姜黄素后，会使该种鱼体内的蛋白质含量有所下降。

该图还显示出在同一测定时间下，田螺体内的蛋白质含量随着目标化合物浓度的变化。由图3可知，在同一测定时间，Sb暴露条件下的田螺体内蛋白质含量随着浓度的增加呈现先增后减的趋势；四环素暴露条件下的田螺体内蛋白质的含量为先增加后减少而后继续增加，在四环素含量为40mg/L和90mg/L时，其体内的蛋白质含量较高；对于在四环素和Sb联合条件下生长的田螺，其体内的蛋白质含量呈现出先降后升的趋势，在37.41mg/L四环素+10.1mg/L Sb条件下生长的田螺体内蛋白质含量最低。由此也可以看出，四环素和重金属Sb的联合效应为拮抗。

2.3 目标化合物对田螺肝胰脏GSH活性的影响

GSH是机体内广泛存在的一种重要的酶，具有抗氧化作用和解毒作用，从而维持机体正常的免疫系统功能。

2.3.1 Sb对田螺肝胰脏GSH活性的影响

由图2可知，在实验开始后24h，田螺肝胰脏的GSH活性随着暴露浓度的增加而降低；随着暴露时间的逐渐增长，在同一测定时间下，田螺肝胰脏的GSH活性随着暴露浓度呈先增加后降低的趋势，且在72～168h的增加最为显著。由此可知，Sb在一定浓度及时间范围内对田螺肝胰脏的GSH活性有抑制作用。

林少琴[10]等的研究表明，Zn2+、Fe3+、Mn2+在体外对蚯蚓体内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)有抑制作用。唐浩[11]等人的研究发现，Hg对土壤球衣体内的GSH-Px有先促进再抑制作用。因此，不同重金属对不同生物体内GSH活性的作用效果不同。

2.3.2 四环素对田螺肝胰脏GSH活性的影响

由图2可知，在实验前72h，暴露在四环素条件下的田螺肝胰脏的GSH活性随着暴露浓度的增加呈现先降低后升高而后降低的趋势，但在最后96h(即168h)时，趋势变为了先增后降再增加。并且各时间各暴露浓度下的GSH活性均高于对照组。

2.3.3 四环素和Sb联合对田螺肝胰脏GSH活性的影响

由图2可知，暴露在四环素和重金属Sb联合作用条件下的田螺肝胰脏GSH的活性在40% LC50联合(即37.41mg/L四环素+10.1mg/L Sb)条件下最高，呈现先增后减的趋势；且在168h时田螺肝胰脏GSH的活性最高，较72h时增加了约90%，说明此时田螺体内的抗氧化作用最强。

2.4 目标化合物对田螺肝胰脏CAT活性的影响

过氧化物酶(CAT)是一种抗氧化酶，主要是在活性氧代谢过程中，将产生的H2O2分解为水和氧气，有效阻止细胞的过氧化损伤[12]。CAT常被作为指示污染胁迫的重要生物标志物[13]。

2.4.1 Sb对田螺肝胰脏CAT活性的影响

由图3可知，在前72h内Sb各浓度暴露条件对田螺肝胰脏的CAT活性有着低浓度抑制、高浓度促进的作用；但随着培养时间的增加，在168h时，Sb对其CAT活性有着相反的作用——低浓度促进、高浓度抑制。其中，Sb浓度为18.9mg/L时的促进作用最为明显。

郭婷[14]对水体中的Cr6+对草鱼肝胰脏CAT活性影响的研究表明，随着时间的延长和培养浓度的增加，CAT的活性整体呈现先上升后下降的趋势；王庆伟[15]在水体中的Cu2+对斑马鱼CAT活性的研究表明，暴露7d后，斑马鱼CAT的活性被抑制，随着暴露浓度的增大，CAT的活性降低且被抑制的程度减弱。

2.4.2 四环素对田螺肝胰脏CAT活性的影响

根据图3的分析可知，四环素暴露条件下田螺肝胰脏CAT活性与Sb暴露条件下有着相反的趋势，在前24h田螺的CAT活性先增加后降低；而后，随着时间的增长，田螺肝胰脏CAT活性呈现低浓度抑制、高浓度促进的趋势。说明田螺的肝胰脏细胞对四环素的胁迫作用产生了应激反应。

2.4.3 四环素和Sb联合对田螺肝胰脏CAT活性的影响

与单一的四环素或Sb对田螺的肝胰脏CAT活性的影响不同，四环素和Sb复合污染物对田螺CAT活性的影响为低浓度促进，高浓度抑制。在暴露条件为37.41mg/L四环素+10.1mg/L Sb时的促进效果最为明显，在24h时CAT的活性约为对照组的2倍，而在168h时约为对照组的3倍。

四环素和Sb联合暴露条件与单一暴露条件对田螺肝胰脏CAT活性影响相同的是，在同一浓度条件下，72h时CAT的活性最低，四环素对CAT的活性有低浓度抑制、高浓度促进的作用。

3 小结

(1)四环素与重金属Sb有轻微拮抗作用。

(2)暴露在四环素、Sb污染条件下的田螺体内蛋白质含量较正常条件下生活的田螺有所减少。

(3)随着时间的延长，各暴露条件下的田螺肝胰脏GSH的活性都有显著的升高。

(4)田螺肝胰脏CAT活性与培养时间和暴露浓度都相关。在前72h Sb对田螺肝胰脏CAT的活性有着低浓度抑制、高浓度促进的作用，随着暴露时间的增加有着完全相反的作用；四环素对田螺肝胰脏的CAT有着低浓度抑制、高浓度促进的作用；而Sb和四环素联合条件对田螺肝胰脏的CAT活性有着低浓度促进、高浓度抑制的作用。