γ—氨基丁酸对内在胆碱能神经兴奋引发的离体胰脏外分泌的影响

权赫然+姜成哲+崔正云

摘 要：本实验的目的在于观察外源性GABA对胰脏内胆碱能神经调节的胰脏外分泌的影响。在灌流摘除的大鼠胰脏模型中观察了GABA对电场刺激唤起的胰脏外分泌作用的影响。GABA的实施在电场刺激六十分钟前开始到实验结束。胰液被收集后检测其总分泌量和淀粉酶产量。河豚毒素和阿托品对胰脏外分泌的影响也被记录。实验结果强烈地提示GABA的实施不影响胰脏内胆碱能神经的功能，但增强胆碱能神经兴奋引起的胰脏外分泌。GABA对胰脏外分泌的作用虽然接受迷走胆碱能神经的兴奋程度的影响，但并不改变胆碱能神经的兴奋度。

关键词：胰脏；γ-氨基丁酸；电场刺激

Abstract： The present study was undertaken to see an effect of GABA on an action of intrapancreatic cholinergic neuron playing a stimulatory role in pancreatic exocrine secretion. In the isolated， perfused rat pancreas， an influence of the vagal cholinergic nerve on a GABA action in EFS-evoked pancreatic exocrine secretion was observed. GABA was intravenously infused from 60min before the EFS to the end of experiment. Pancreatic juice was collected and then volume flow and amylase output were determined. TTX was administrated prior to the experiment. Atropine was administrated from 60 min before the EFS to the end of experiment. The results strongly suggest that GABA does not modify the activity of intra-pancreatic cholinergic neurons but enhances pancreatic exocrine secretion evoked by activation of the cholinergic neurons. The action of GABA on pancreatic exocrine secretion is under an influence of the vagal cholinergic tone but GABA does not modify the cholinergic tone.

Keywords：Pancreatic； gamma-aminobutyric acid； electrical field stimulation

前言

胰臟是分泌胰岛素等的内分泌部散在分泌胰蛋白酶等消化酶及重碳酸离子（HCO3-）、水份的外分泌部的混合腺体器官。流入胰脏的血液大部分都流入外分泌部，大约10%的血液经过在内分泌部形成毛细血管网后再经过外分泌部形成毛细血管网，即先后流过所谓的胰岛腺泡门脉体系[1]。

γ-氨基丁酸（GABA）最初被从哺乳类的脑组织中发现，之后也从心血管系统、胃肠管系统、泌尿生殖系统等神经系统以外的脏器中被发现[2]。特别是在胰脏胰岛的β-细胞中也存在相当于脑组织中存在量的高浓度GABA，而且胰脏胰岛的β-细胞中还发现参与GABA生物合成的合成酶和参与其代谢过程的代谢酶[3]。因此，GABA可能在β-细胞中合成并代谢，但迄今为止GABA是否由胰脏的胰岛分泌出来的问题，还没找到直接证据。但GABA由胰岛分泌的可能性很大。并且胰小叶内胰管细胞和腺泡中心细胞中都观察到了GABA的高亲和性结合部位[4]。如果GABA真的由胰岛分泌，可以推测它将经过胰岛-腺泡门脉系统，影响胰脏外分泌功能的可能性极高。

之前有文章发表了利用白鼠灌流摘出的胰脏观察的外源性GABA对胰脏外分泌的影响。根据这份报告外源性GABA对自发性胰脏外分泌或secretin诱发的胰脏外分泌没有影响，但是大幅上升由主要促进酶分泌的GRP或CCK诱发的胰脏外分泌或由电场刺激诱发的胰脏外分泌。电场刺激激活胰脏的内在神经促进外分泌[5]，从上述实验结果来看，GABA对内在神经对胰脏外分泌的作用有可能起到上升作用。胰脏中存在的神经中最多的是胆碱能神经，这对胰脏外分泌起到促进作用是众所周知的。因此，在本研究中作为阐明GABA对胰脏外分泌的影响机制的一环，利用白鼠灌流摘出的胰脏想要证明对胰脏外分泌有促进性作用的胰脏内在胆碱能神经作用的GABA的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验中使用了体重在250-300g的Sprague-Dawley系的雄性大鼠，在开始实验前24小时起只供应水实施禁食。通过腹腔注射20%乌拉坦溶液麻醉实验动物，用量为每公斤体重7ml。在麻醉的状态下结束实验或摘出胰脏后静脉输注过量的乌拉坦杀死实验动物。每组实验动物为六只。

1.2 灌流摘出大鼠胰脏中GABA对电刺激诱发的胰脏外分泌的影响

1.2.1 白鼠的灌流摘出胰脏模型的制备。胰脏的摘出按已经发表的方法[5]进行。

1.2.2 对灌流摘出的胰脏进行电刺激术。为激活灌流摘出的胰脏内在神经进行了以下的电场刺激术。在装有灌流摘出的胰脏的实验箱中放置间隔5cm的两根螺线形铂线，然后将胰脏放置在两根铂线之间，利用电刺激器（BioScience.UK）加以15V，2msec，8Hz的直流电流。

1.2.3 GABA对电场刺激诱发的胰脏外分泌的影响。记录白鼠的灌流摘出的胰脏在基础状态下的胰液分泌量及淀粉酶的量。然后对灌流摘出胰脏加以电场刺激，间隔15min，测量一次胰液及淀粉酶的含量。在电场刺激一小时前起，将GABA以10？的浓度对动脉进行给药，并施加电场刺激，观察胰液分泌量。每隔15min记录数据。

1.2.4 在GABA作用下，阿托品对在电场刺激下诱发的胰脏外分泌的影响。在电场刺激1小时前开始向灌流摘出的胰脏动脉给药10μM浓度的GABA，观察GABA对电场刺激诱发的胰脏外分泌的影响。为了确认电场刺激是否激活胰脏内在神经，边给药1μM浓度的抑制神经活性的河豚毒素，观察由电刺激诱发的胰脏外分泌的GABA的效果。并且为了确认电场刺激是否激活胰脏内在神经中的胆碱能神经，以2μM的浓度给药阿托品，观察GABA对电场刺激的效果。阿托品从电场刺激1小时前开始与GABA一起一直给药。下面的图1简要展示了实验的过程。

1.3 GABA对乙酰胆碱诱发的胰脏外分泌的影响

为观察GABA对Choline能神经传达物质诱发的胰脏外分泌的影响对灌流摘出的胰脏给药10，30，100μM浓度的GABA，并于1小时后以5μM的尝试给药乙酰胆碱1小时。

1.4 测定胰液中的α-淀粉酶活性

胰液中的α-淀粉酶活性是按已经发表的方法[5]测定的。

1.5 测试值的统计处理

本实验中得到的所有测定值按平均±标准偏差给出。平均差用Student's t test进行了统计学验证，显著性水平为5%。

2结果

2.1 灌流摘出的白鼠胰脏中，GABA对内在神经的活性化诱发的胰脏外分泌的影响

2.1.1 GABA对电场刺激诱发的胰脏外分泌的影响。白鼠的灌流摘出胰脏在基础状态下各分泌胰液及淀粉酶的量为0.38±0.05 /15min和3.91±1.16U/15min。如加电场刺激则胰液分泌量增加，在电场刺激后15分钟时为4.72±0.37 /15min，30分钟时为4.66±0.29 /15min，45分钟时为3.80±0.32 /15min，amylase分泌量也有所增加，在電场刺激后15分钟时为69.42±7.84U/15min，30分钟时为70.14±6.74U/15min，45分钟时为57.22±4.46U/15min。

在开始电场刺激一小时前起，将GABA以10μM的浓度给药到动脉内，并施加电场刺激，则胰液分泌量增加，在电场刺激后15分钟时为6.38±0.26 /15min，30分钟时为5.55±0.27 /15min，45分钟时为4.71±0.30 /15min，amylase分泌量也有所增加，在电场刺激后15分钟时为139.03±11.24U/15min，30分钟时为108.74±11.25U/15min，45分钟时为97.28±7.91U/15min。

在给药GABA时加电场刺激的情况下胰液分泌量在15分钟时较不给药GABA只加电场刺激时所得的相应值相比有显著的增加（P<0.05），在其他时间段胰液分泌量只显示为增加的倾向，但amylase分泌量在所有时间段都比不给药GABA，只加电场刺激时所得的相应值有显著的增加（P<0.05）。另外GABA对自发的胰液分泌量及淀粉酶分泌没有任何影响。

2.1.2 河豚毒素和阿托品对GABA作用的影响。如图3所示，白鼠灌流摘出的胰脏加以45分中电场刺激，胰液分泌量和淀粉酶分泌量各达到13.17±1.04 /45min和196.78±16.88U/45min。电场刺激诱发的胰液分泌量和淀粉酶分泌量因河豚毒素的加入各显著减少为4.32±0.64 /45min和62.28±4.36U/45min（P<0.01），因阿托品的加入也各显著抑制到6.47±0.77 /45min和92.13±5.96U/45min（P<0.01）。

如图4所示，白鼠灌流摘出的胰脏边给药GABA边施加45分钟的电场刺激，胰液分泌量和amylase分泌量各为16.91±0.71 /45min和345.05±28.04U/45min。在给药GABA的情况下，由电场刺激诱发的胰液分泌量和淀粉酶分泌量因加入河豚毒素各显著减少为6.56±0.52 /45min和78.61±7.71U/45min（P<0.01），因加入阿托品也各显著抑制到8.16±0.78 /45min和108.07±5.40U/45min（P<0.01）。

给阿托品的情况下，在边给药GABA，边施加电场刺激所得到的胰液分泌量比只施加电场刺激所得到的胰液分泌量虽不显著但显示增高的倾向（P<0.1），淀粉酶分泌量则比只加电场刺激所得到的量都显著增高（P<0.05）。

2.1.3 GABA对乙酰胆碱诱发的胰脏外分泌的影响

图5所示的是GABA对白鼠灌流摘出的胰脏由乙酰胆碱诱发的胰脏外分泌的影响。白鼠灌流摘出的胰脏给药5μM的乙酰胆碱则胰液分泌量和淀粉酶分泌量都比基础状态各显著增加到17.60±2.12 /60min和310.01±25.51U/60min（P<0.01）。

以10，30及100μM的浓度动脉给药GABA并给药乙酰胆碱，胰液分泌量随GABA的浓度各显著增加到28.89±4.58 /60min，43.34±5.24 /60min和39.31±6.34 /60min（P<0.01），淀粉酶分泌量各显著增加到569.86±65.13U/60min，704.38±39.15U/60min及601.36±78.39U/60min（P<0.01）。因此GABA浓度依赖性地上升了由乙酰胆碱诱发的胰脏外分泌。

3 讨论

这次实验结果中发现GABA虽然不影响自发的胰脏外分泌，但对CCK诱发的胰脏外分秘有上升作用（5），在本实验中观察了GABA对胰脏内在的胆碱能神经的活性化诱发的胰脏外分泌的效果。在完全阻断外界影响的灌流摘出胰脏中，如以电场刺激胰脏内在神经，胰液和淀粉酶的分泌大为增加。GABA（10μM）更是把电场刺激诱发的胰液和淀粉酶分泌量各上升28.4%和75.3%。河豚毒素则在给药GABA的情况下对电场刺激诱发的胰液和淀粉酶分泌量各降低了62%和77%。已知河豚毒素是阻断电场刺激激活胰脏内在神经的物质[6]，上述结果可能是因为GABA促进激活胰脏内在神经诱发的胰脏外分泌。另外用阿托品处理灌流摘出的胰脏来阻断胆碱能神经的传达后，再给药GABA时，由电场刺激诱发的胰液和淀粉酶分泌量各减少52%和69%。因此得出结果为GABA促进胰脏内在胆碱能神经活性化诱发的胰脏外分泌。

为证明GABA促进胰脏内在胆碱能神经活性化诱发的胰脏外分泌的可能性，在本实验中又观察了GABA对胆碱神经传递物质作用的效果。白鼠灌流摘出的胰脏给药5μM尝试的胆碱能神经传达物质乙酰胆碱，则胰液和淀粉酶的分泌量比基础状态时各增加了1000%和1880%。GABA浓度为10，30及100μM时，乙酰胆碱诱发的胰液和淀粉酶的分泌量出现浓度依赖性的增加。这样的结果有力地证明GABA对胰脏内在胆碱能神经的活性化诱发的胰脏外分泌有促进作用的可能性。

本实验中对白鼠灌流摘出的胰脏进行阿托品处理来阻断胆碱能神经的作用，在给药GABA的情况下施加电场刺激所诱发的胰脏外分泌也大于单独电场刺激诱发的胰脏外分泌。这样的结果认为是GABA对电场刺激的效果有部分残留，进而电场刺激也激活胰脏内在神经中的胆碱能神经以外的神经，GABA可能对这个神经分泌的传达物质对胰脏外分泌的促进作用增加。胰脏中存在非胆碱能神经--GRP能神经，这一神经分泌的GRP对胰脏外分泌已知对胰脏外分泌有促进作用。本研究室已发表了白鼠的灌流摘出胰脏施加电场刺激，则不仅GRP分泌增加，而且电场刺激诱发的胰脏外分泌因着抗GRP血清被抑制（7）。并且发现白鼠灌流摘出的胰脏在加给药GABA，边施加电场刺激诱发的胰脏外分泌在给药抗GRP的情况下抑制30%[7]。这些结果和本实验的结果，认为电场刺激激活胰脏内在的GRP能神经，GABA对GRP能神经的活性化诱发的胰脏外分泌也有上升作用。

参考文献

[1]Ohtani O and Wang QX. Comparative analysis of insulo-acinar portal system in rats， guinea pigs， and dogs. Microsc. Res. Tech. 37：489-496， 1997.

[2] Erdo SL and Wolff JR. γ-Aminobutyric acid outside the mam- malian brain. J. Neurochem. 54：363-372， 1990.

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[6]Park HS， Kwon HY， Lee YL， Chey WY and Park HJ. Sig- nificant cholinergic role in secretin-stimulated exocrine secretion in isolated rat pancreas. Am. J. Physiol. 274： G413-G418， 1998.

[7]Park HS， Kwon HY， Lee YL， Chey WY and Park HJ. Role of GRPergic neurons in secretin-evoked exocrine secretion in isolated rat pancreas. Am. J. Physiol. 278： G557-G562， 2000.

通訊作者：崔正云。