高压氧对2型糖尿病小鼠摄食及胰岛素敏感性的影响

宋莉敏 刘媛 张迪 袁骏华 张彩顺 董静，2

(青岛大学，山东 青岛 266071 1 基础医学院特种医学系； 2 生理学教研室)

2型糖尿病(2DM)是最常见的DM类型,患者由于胰岛素分泌相对不足和外周胰岛素抵抗可导致高糖血症[1]，其并发症对人们健康有着严重影响[2]。高压氧(HBO)疗法是指在高于周围环境大气压的压力下使用高浓度的氧气进行治疗[3]。HBO疗法作为一种安全的非侵入性方式，可增加组织和微血管系统的氧气浓度，临床上主要用于治疗患者一氧化碳中毒及组织栓塞、缺血等疾病[4-7]。近年来研究发现，HBO可以改善DM患者血糖水平、DM病足和DM神经性病变[8-12]。目前研究表明，HBO治疗对DM患者的动脉粥样硬化和血糖控制有益[13]。HBO可增强骨骼肌中的葡萄糖和脂质代谢[14]，表明HBO可预防DM大鼠的血糖升高和脂肪细胞肥大，降低DM大鼠血糖水平并且改善骨骼肌的氧化能力[15]。但是对HBO与2DM小鼠摄食水平以及胰岛素抵抗的关系尚缺乏深入研究。本实验旨在观察HBO是否会影响2DM小鼠摄食水平以及改善胰岛素抵抗，并且采用免疫荧光方法观察HBO对于下丘脑弓状核神经肽Y表达的影响，从而进一步完善HBO对DM治疗作用的研究。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 动物来源

5周龄雄性C57BL/6J小鼠35只，体质量约为15 g，购于青岛市药品检验所。

1.2 小鼠2DM模型的制备

小鼠以高脂饮食(HFD)(含质量分数0.59的普通鼠粮，质量分数0.20的糖，质量分数0.18的猪油和质量分数0.03的蛋黄)喂养1周后，连续3 d每天注射低剂量链脲佐菌素(STZ,60 mg/kg，美国Sigma-Aldrich公司)，继续HFD喂养6周，同时以同周龄仅以HFD喂养并注射柠檬酸钠缓冲溶液的C57BL/6J小鼠作为对照组。小鼠饲养于标准动物房，室温(23±2)℃，7：00～19：00点进行光照，严格按照12-12 h昼夜循环，湿度50%～60%，自由饮水和进食。以空腹血糖水平高于12 mmol/L并且稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)异常增高，为2DM小鼠造模成功[16]。

造模成功的15只小鼠随机分为2DM组(7只小鼠)和2DM+HBO组(8只小鼠)，HFD的小鼠随机分为HFD组(6只小鼠)以及HFD+HBO组(7只小鼠)。HFD+HBO组、2DM+HBO组小鼠置于动物高压氧舱(烟台冰轮高压氧舱有限公司)内每天18：00～19:00 HBO治疗。HBO治疗开始时，纯氧洗舱10 min，5 min内将舱内压力升至2个绝对大气压，然后在2个绝对大气压，体积分数1.00氧气下持续暴露60 min，治疗结束以后将舱内压力在5 min内缓慢降低至室内压。HBO治疗每天1次，持续1周。HFD组和2DM组小鼠置于相同环境，不做处理。处理小鼠的规程由青岛大学动物保护和使用委员会认证。本研究符合国立卫生研究院《实验室护理与使用指南》的指导方针。

1.3 观察指标及测定方法

1.3.1小鼠血糖水平、HOMA-IR以及摄食量测定采用德国贝朗倍佳血糖仪于1周HBO治疗结束后小鼠尾静脉采集血标本，常规测定空腹血糖水平，采用小鼠酶联免疫吸附实验试剂盒测定空腹血浆胰岛素(CEA448Mu,武汉优尔生商贸有限公司)水平。通过以下公式计算HOMA-IR[17]：HOMA-IR=空腹血浆胰岛素(mU/L)×空腹血浆葡萄糖(mmol/L)/22.5。在HBO治疗的第7天，于13：00禁食，HBO结束后给予HFD，并测量第1～12小时的累积摄食量。

1.3.2免疫荧光法检测小鼠下丘脑弓状核神经肽Y阳性神经元表达 HBO治疗结束后，所有小鼠分别腹腔注射8 g/L水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉，心脏灌注后，迅速断头取脑置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，于4 ℃冰箱固定24 h后，再用300 g/L蔗糖溶液脱水24 h。根据小鼠大脑立体定位图谱对下丘脑弓状核核团行10～15 μm厚冰冻切片，切片置于载玻片上。切好的脑片于60 ℃温箱中烘烤4 h以后，用PBST溶液浸泡20 min，置于修复液内，用微波炉95 ℃中火抗原修复10 min，待自然冷却以后PBST溶液洗涤3次，每次7 min。用小牛血清室温封闭2 h，加入神经肽Y抗体(羊抗鼠，1∶100,英国Abcam公司)后4 ℃下继续孵育脑片12 h，PBST溶液冲洗3次后，加入荧光标记的驴抗羊IgG(NL101, 1∶200，美国R&D Systems公司)后室温下继续避光孵育2 h，PBST溶液洗片后，使用封片液(PBST和甘油体积比为1∶1)封片，荧光显微镜下观察神经肽Y的表达。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 HFD组与2DM组小鼠血糖水平和HOMA-IR比较

HFD组及2DM组小鼠的空腹血糖水平分别为(6.43±0.30)、(15.12±1.18)mmol/L，2DM组小鼠的空腹血糖水平较HFD组明显增高(t=-6.953，P<0.05)；HFD组、2DM组小鼠HOMA-IR分别为1.49±0.41、5.16±1.67，2DM组小鼠的HOMA-IR较HFD组小鼠明显增高(t=-5.219，P<0.05)。

2.2 各组小鼠HBO治疗前后空腹血糖差值以及HOMA-IR比较

HFD组、HFD+HBO组、2DM组和2DM+HBO组小鼠HBO治疗前后空腹血糖差值分别为(1.21±1.60)、(2.60±1.95)、(7.50±4.37)、(-1.16±2.57)mmol/L，而各组治疗1周后HOMA-IR分别为14.39±7.87、14.30±6.31、45.33±12.81、31.98±11.05。与2DM组相比，2DM+HBO组小鼠空腹的血糖以及HOMA-IR显著改善(F=11.206、36.567，P<0.05)。与HFD组相比，HFD+HBO组小鼠治疗1周后空腹血糖差值和HOMA-IR差异并无显著统计学意义(P>0.05)。

2.3 2DM小鼠累积摄食量和下丘脑弓状核神经肽Y表达比较

第1～12小时小鼠累积摄食量检测结果显示，与2DM组相比，2DM+HBO组小鼠第11小时和第12小时累积摄食量显著增加(F=5.635、7.598，P<0.05)；而HFD组和HFD+HBO组之间的累积食物摄入量没有显著统计学差异(P>0.05)。见表1。下丘脑弓状核免疫荧光显示，与HFD组相比，2DM小鼠弓状核神经肽Y表达增加。与2DM组相比，2DM+HBO组小鼠弓状核神经肽Y表达增加，但HFD组与HFD+HBO组之间没有显著统计学差异(图1)。

表1 HBO治疗对小鼠累积摄食量的影响

A：HFD组，B：HFD+HBO组，C：2DM组，D：2DM+HBO组。免疫荧光法，200倍

3 讨 论

DM是人群中最常见的代谢紊乱，主要影响细胞两大营养物质即碳水化合物以及脂质的代谢，导致代谢途径的破坏以及有害代谢物的产生。

躯体的功能和活动需要通过食物摄入获取能量，而食物的摄入量会受到饥饿、压力以及其他条件的影响[18]。中枢神经系统对摄食主要通过弓状核中的神经元进行调节，其中厌食神经元表达黑素皮质素抑制进食，促食欲神经元表达神经肽Y刺激进食[19]。研究表明，与正常人相比，2DM患者循环系统中神经肽Y表达会增加[20]，本实验结果显示，与HFD组相比，2DM组小鼠下丘脑弓状核神经肽Y表达增加。在本研究中，HBO+2DM组小鼠累积摄食量增加，同时弓状核中神经肽Y的表达增加，但空腹血糖水平明显降低，表明HBO治疗可能通过改善2DM小鼠葡萄糖的转运及氧化利用而降低血糖水平[21-22]。本研究结果还显示，经HBO治疗后2DM小鼠胰岛素敏感性明显升高。葡萄糖转运体4(GLUT4)是依赖于胰岛素IRS1-Akt-GLUT4信号通路促进葡萄糖向细胞内转运的蛋白，因此，GLUT4被认为是机体内葡萄糖稳态的重要调节剂[23]。2DM小鼠的骨骼肌不仅对胰岛素的敏感性下降，而且GLUT4的表达水平也同时降低，这使得葡萄糖的吸收以及利用能力降低从而使血糖水平上升[24-25]。另外，本研究结果还表明，HBO治疗可改善2DM小鼠HOMA-IR，由此推测HBO通过促进Akt蛋白磷酸化进一步激活来促进GLUT4膜转运，从而使得血糖水平降低，但是此猜想还需要进一步的验证。

另外本研究结果显示，与HFD组相比，HFD+HBO组小鼠累积摄食量呈现降低的趋势，但血糖却无明显变化。研究表明缺氧可刺激白色脂肪细胞产生与炎症相关的脂肪因子，导致胰岛素抵抗[26-27]。脂肪酸的氧化与食物摄入的调节密切相关[28]。脂肪细胞分泌的脂肪因子例如瘦素，通常在胰岛素抵抗模型中增加，并与食欲调节有关系[29]。因此，对于HFD+HBO组小鼠累积摄食量变化可能的解释是HBO影响了调节脂质代谢的脂肪因子的释放，这是一个需要进一步探讨的方向。

研究表明HBO治疗的主要机制是增加组织氧分压[30-31]。但是氧分压改善胰岛素敏感性的机制还需要进一步探究。

总之，HBO增加了2DM小鼠累积摄食量及弓状核中神经肽Y的表达，同时还改善了胰岛素敏感性。本研究为HBO治疗2DM提供了一定的理论依据。