抗凋亡蛋白ARC对人主动脉血管平滑肌细胞凋亡的影响

刘梦馨 杨茜 张京，3 王建勋

(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071； 2 青岛大学附属医院心内科； 3 青岛大学转化医学研究院)

动脉粥样硬化是最常见和最具危害性的疾病之一，严重影响人们的生命安全和生活质量[1-2]。血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡是动脉粥样硬化发生发展的主要诱因。因此，针对调控VSMC凋亡的研究对预防和治疗动脉粥样硬化具有重要的医学意义。ARC是一种内源性的凋亡抑制蛋白，在终末分化细胞如心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞中高表达[3-5]。ARC可以抑制多种细胞死亡途径，包括由外源性(死亡受体)和内源性(线粒体/内质网)凋亡途径引发的细胞死亡，以及氧化应激诱导的不依赖于caspase的细胞死亡[6-7]。近年来有关ARC的研究主要在心肌细胞中进行，有研究发现ARC通过抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用[8]。心肌细胞中ARC表达下调与心肌梗死、心肌肥大等心血管疾病的发生发展密切相关[9-10]。我们以前的研究发现，ARC不仅能够抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡[11]，而且还可以抑制缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞程序性坏死。也有研究显示，ARC在肿瘤细胞、组织中高表达[12-13]。以上证据表明ARC可能参与调控了心肌细胞和肿瘤细胞等多种细胞的凋亡。值得关注的是，最近有研究表明，经无血清培养(SD)后肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中ARC的表达上调，并且ARC还可抑制SD诱导的PASMC的凋亡[14]。在慢性缺氧条件下，ARC敲除后PASMC的凋亡增加，这表明ARC在调控PASMC凋亡的过程中发挥至关重要的作用[15]。然而ARC能否在人主动脉VSMC(HA-VSMC)中表达，是否参与调控HA-VSMC的凋亡尚不清楚，本研究旨在进一步探讨ARC对HA-VSMC凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

HA-VSMC、大鼠心肌细胞(H9c2)、人胚胎肾细胞293(HEK293)、人主动脉内皮细胞(HAEC)为本实验室所有，在液氮中冻存；ARC抗体购自美国CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将H9c2、HA-VSMC、HAEC以及HEK293接种在含体积分数0.10胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 kU/L青霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中培养，培养到对数生长期用于后续实验。

1.2.2腺病毒的扩增和感染 ARC和β-gal过表达腺病毒为本实验室所存[16]。将HEK293细胞接种于细胞培养皿中，当细胞密度达到100%时，加入腺病毒进行感染。3 d后，当细胞出现空洞，收集细胞，于-80 ℃反复冻融3次后，以12 000 r/min离心5 min，收集上清液中更多的腺病毒，于-80 ℃保存，用于后续实验。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞ARC的相对表达水平 在6孔板中常规培养H9c2(A组)、HA-VSMC(B组)、HAEC(C组)、HEK293(D组)，当细胞密度达到80%及以上时，弃去培养基，用PBS冲洗3次，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后置于1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol RNAiso(日本Takara公司生产)提取细胞总RNA，然后使用Takara逆转录试剂盒将总RNA逆转录成为cDNA，最后采用Takara荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR。

在6孔板中常规培养HA-VSMC，当细胞密度达到70%时，采用100 μmol/L的H2O2时间梯度处理HA-VSMC诱导细胞凋亡，实验分为对照组(A组)、H2O2+3 h组h(B组)、H2O2+6 h组(C组)、H2O2+12 h组(D组)。加入1 mL Trizol RNAiso试剂提取总RNA，再采用Takara逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，最后采用Takara荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测细胞ARC的表达。

ARC引物：正向5′-GACCGCAGCTATGACC-CTC-3′，反向5′-CTCCGGTTCAGCCTCTTTAGA-3′。GAPDH引物：正向5′-TGTGTCCGTCGTGG-ATCTGA-3′，反向5′-CCTGCTTCACCACCTTC-TTGA-3′。

1.2.4Western blot方法检测细胞中ARC的相对表达量 在6孔板中常规培养HA-VSMC，实验分为对照组(A组)、β-gal组(B组)、Ad-ARC组(C组)，当细胞密度达到70%左右时，加入腺病毒感染细胞24 h后，收集各组细胞提取总蛋白，注意全程在冰上进行避免蛋白降解。然后按照比例加入4×上样缓冲液，涡旋混匀后，使用金属浴于98 ℃加热10 min。在SDS-PAGE凝胶中上样30 μg蛋白溶液，80 V电压下压线，待样品压平以后，电压改为120 V恒压1.5 h。后用体积分数0.05脱脂牛奶室温封闭1 h，加入ARC一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min；后用HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后用ECL蛋白质印迹底物检测条带，并在蛋白凝胶成像系统上曝光。

1.2.5caspase3/7活性实验检测ARC对H2O2诱导的细胞凋亡的影响 在96孔板中常规培养HA-VSMC，实验分为对照组(A组)、H2O2(B组)、H2O2+β-gal(C组)、H2O2+Ad-ARC(D组)。当细胞密度达到大约70%时，加入腺病毒感染细胞24 h，再加入H2O2继续培养12 h后，弃去培养基，用PBS洗3次；加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集细胞于1.5 mL离心管中；后根据caspase 3/7活性测定试剂盒(meilunbio，中国大连)说明书操作，最后使用酶标仪检测405 nm波长下的吸光度值。

1.2.6锥虫蓝染色实验检测ARC对于H2O2诱导的细胞凋亡的影响 在6孔板中进行常规培养HA-VSMC，实验分为对照组(A组)、H2O2(B组)、H2O2+β-gal(C组)、H2O2+Ad-ARC(D组)。当细胞密度约70%时，加入腺病毒感染细胞24 h，再加入H2O2继续培养12 h后，弃去培养基，用PBS洗3次；加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集细胞于1.5 mL离心管中；取10 μL细胞悬液与10 μL锥虫蓝工作液混匀，室温静置3 min；然后用血细胞计数板在光学显微镜下计数。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 ARC在不同细胞系中的相对表达量

RT-qPCR检测结果显示，A、B、C、D组细胞ARC相对表达量分别为1.00±0.01、0.70±0.02、0.30±0.01、0.05±0.00，B组和C组细胞ARC的表达量比较差异具有显著性(F=84.50，t=8.67，P<0.05)。因此，本研究将HA-VSMC作为主要研究对象。

2.2 H2O2处理后各组细胞ARC相对表达量比较

RT-qPCR检测结果显示，A、B、C、D组中ARC相对表达量分别为1.00±0.01、0.80±0.02、0.60±0.05、0.40±0.01，与A组相比，随着H2O2处理时间的延长，细胞中ARC相对表达量逐渐降低，差异有显著性(F=8.83，P<0.05)。

2.3 转染Ad-ARC和β-gal对HA-VSMC ARC表达的影响

Western blot检测结果显示，A、B、C组HA-VSMC ARC相对表达量分别为1.00±0.01、1.01±0.02、5.20±0.20，与A、B组相比，C组中ARC相对表达量显著上调，差异具有显著性(F=296.00，P<0.01)，即成功在HA-VSMC中构建ARC的过表达腺病毒。见图1。

图1 Ad-ARC在HA-VSMC中过表达

2.4 过表达ARC对HA-VSMC凋亡的影响

2.4.1过表达ARC对HA-VSMC caspase3/7活性的影响 酶标仪检测结果显示，A、B、C、D组HA-VSMC的吸光值分别为0.99±0.05、3.92±0.20、3.89±0.50、2.18±0.01，C组和D组间比较差异具有显著性(F=55.46，t=6.96，P<0.05)。

2.4.2ARC对细胞凋亡的抑制作用 锥虫蓝染色实验结果显示，A、B、C、D组细胞锥虫蓝阳性细胞数分别为4±2、28±4、29±5、15±2，C组和D组间比较差异有显著性(F=190.10，t=12.40，P<0.05)。

3 讨 论

细胞凋亡在动脉粥样硬化斑块形成及再狭窄的发生发展中具有重要作用，在动脉粥样硬化的斑块中有多种细胞发生凋亡，如VSMC、内皮细胞、巨噬细胞等[17]。针对细胞凋亡在动脉粥样硬化中相关分子机制的深入研究，可以帮助寻找新的治疗靶点。VSMC的凋亡是多种血管疾病，如动脉粥样硬化和肺动脉高压等中最常见的病理过程[18-19]。因此，针对调控VSMC凋亡的研究，对寻找血管疾病新的治疗方法具有重要意义。

本研究结果显示，ARC在HA-VSMC中表达且表达量高于在HAEC中，推测ARC可能在HA-VSMC中发挥作用。近年来有关ARC的研究主要在心肌细胞和肿瘤细胞中进行，研究显示ARC通过抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用，ARC在肿瘤细胞和组织中高表达,从而发挥其抗凋亡的功能。但是ARC是否参与调控HA-VSMC的凋亡尚不清楚。

在动脉粥样硬化发展中的不同时期，VSMC的凋亡程度也不同，在斑块期VSMC的凋亡明显增加，VSMC的凋亡是动脉粥样硬化发展过程的的重要因素[20]。本研究结果进一步显示，在H2O2诱导细胞凋亡的条件下，ARC的表达量明显下调，我们推测ARC可能参与H2O2诱导的细胞凋亡。在本研究中,使用腺病毒Ad-ARC在HA-VSMC中过表达ARC，Western blot实验检测结果显示C组中ARC的蛋白表达水平较A组和B组明显增高，这表明在转染Ad-ARC后HA-VSMC中的ARC被显著过表达。进一步通过caspase3/7活性实验和锥虫蓝染色实验证明，在H2O2处理HA-VSMC的同时过表达ARC，过表达的ARC可以明显地抑制H2O2诱导的细胞凋亡。以上结果均证明了ARC在抑制HA-VSMC凋亡中的关键作用，因此我们推测ARC有可能为治疗动脉粥样硬化和其他血管疾病提供新的靶点。

在动脉粥样硬化的发展过程中，VSMC的增殖也伴随始终。有研究显示，在慢性缺氧的条件下，ARC敲除小鼠对肺动脉高压有明显的抗性，并且敲除ARC后PASMC的增殖减少，细胞凋亡增加[15]。ARC可拮抗唑来磷酸对成骨细胞产生的不利影响，从而促进成骨细胞的生长和分化，并且降低细胞凋亡[21]。ARC的过表达通过与caspase作用而抑制肌原细胞分化[22]。以上证据表明ARC还可以参与调节细胞的增殖和分化。但ARC能否在VSMC的增殖中发挥作用还缺乏更深入的研究，有关ARC与VSMC增殖关系的研究我们正在开展。

综上所述，本研究结果显示，抗凋亡蛋白ARC在HA-VSMC当中高表达，过表达ARC可以抑制H2O2诱导的HA-VSMC的凋亡，其发挥作用的具体分子机制还需要进一步深入研究。