RRS1在MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中表达的变化及意义

能一鸣 张峥 李雪 王芳玲 华亚男 侯琳

(青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系，山东 青岛 266071)

核糖体合成调节因子1(RRS1)是一种调控蛋白，其主要功能是与核糖体产物因子2(RPF2)相互作用，招募核蛋白RPL5、RPL11以及5SrRNA并参与核糖体5SRNP的成熟、60S大亚基的组装和转运[1-3]。编码RRS1蛋白的基因缺失或突变会引起核糖体组装异常，进而影响细胞的正常生命活动[4]。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)是一种常用的帕金森病(PD)模型构建诱导剂，通过抑制细胞线粒体活性，促进氧化应激，引起多巴胺能神经元的凋亡[5]。研究发现RRS1的异常表达与人类肿瘤和神经退行性疾病相关[6-8]，在乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肝癌和结肠癌中，RRS1被认为与细胞的异常增殖相关，下调RRS1表达会引起细胞增殖抑制和凋亡[9-14]。为了解RRS1与多巴胺能神经元细胞凋亡的关系，本实验设计不同剂量的MPP+处理 SH-SY5Y细胞，分析细胞损伤凋亡与RRS1蛋白表达的相关性，再通过慢病毒过表达RRS1基因，观察SH-SY5Y细胞经MPP+处理后细胞凋亡程度的变化，以及相关凋亡蛋白表达情况的变化，探讨RRS1与MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的关系及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SH-SY5Y细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清、DMEM/HIGH培养基(美国Hyclone公司)，MPP+(美国Sigma公司)，胰蛋白酶消化液(0.53 nmol/L)、RIPA蛋白质提取试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒、CCK-8试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)，JC-1试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，兔抗人RRS1单克隆抗体及Bax、Bcl-2、β-Actin抗体(美国Abcam公司)，兔抗人P53多克隆抗体以及GAPDH抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)，Anexin V-APC/PI试剂盒(美国Thermo Fi-sher Scientific公司)，慢病毒载体及转染试剂(上海吉凯公司)，qPCR、PCR反转录试剂盒和引物(北京全式金生物有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 将SH-SY5Y细胞置于含体积分数0.15胎牛血清的DMEM培养基中于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中培养。取对数期生长的细胞并用胰蛋白酶消化，细胞计数以后按照1×106个细胞/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合度达到70%时，进行后续实验。

1.2.2CCK-8检测细胞的增殖活力 将对数生长期的SH-SY5Y细胞消化接种于96孔板中，设置4个浓度梯度组(每组5个复孔，每孔3 000个细胞)，细胞贴壁以后每孔加入含有不同浓度(0、100、200和400 μmol/L)MPP+的培养基100 μL，继续培养48 h，检测前1 h每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育1 h,以酶标仪于波长450 nm处检测各孔吸光度(A)值，并计算细胞活力。实验重复3次,取均值。

1.2.3JC-1法检测细胞线粒体膜电位变化 将对数生长期的SH-SY5Y细胞消化接种于6孔板中，每孔加入培养基2 mL，在细胞融合度达到70%时，弃去原培养基，加入含有不同浓度(0、100、200和400 μmol/L)MPP+的培养基继续培养24 h，吸去上清液，每孔加入1 mL培养基和1 mL JC-1染色工作液，充分混匀，置于细胞培养箱中37 ℃避光孵育20 min。孵育结束以后，吸去上清液，每孔用1×Loading buffer洗涤2次，最后每孔再加入2 mL细胞培养基，荧光显微镜拍照，线粒体膜电位由细胞红绿荧光强度比值表示，实验步骤参照说明书进行。

1.2.4Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡情况 取对数生长期的SH-SY5Y细胞消化接种于6孔板，待细胞融合度约70%时，更换含有0、100、200和400 μmol/L MPP+的培养基继续培养48 h，小心收集细胞，按照Annexin V-APC/PI实验说明书检测细胞凋亡情况。以Annexin V-APC(-)/PI(+)为坏死细胞标准，以Annexin V-APC(+)/PI(+)为晚期凋亡细胞标准，以Annexin V-APC(+)/PI(-)为早期凋亡细胞的标准，以Annexin V-APC(-)/PI(-)为正常细胞的标准。

1.2.5Western blot检测细胞P53、RRS1、Bcl-2以及Bax的表达 用含有0、100、200和400 μmol/L MPP+的培养基培养对数生长期的SH-SY5Y细胞48 h，弃去培养基，用PBS轻轻冲洗1次；用RIPA裂解法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；加入1/4体积的5×loading buffer后煮沸10 min使蛋白质高温变性；按30 μg总蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳和电转，电转结束后用含有50 g/L BSA的封闭液室温封闭2 h；分别加入一抗Anti-RRS1(1∶1 000)、Anti-P53(1∶1 000)、Anti-Bcl-2(1∶1 000)、Anti-Bax(1∶1 000)、Anti-GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10 min；加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，重复TBST的洗膜步骤；将ECL显影液滴加至PVDF膜上，避光1 min；放入成像系统显影拍照并分析条带灰度值；以GAPDH为内参照，将目的蛋白与内参照的灰度值进行比较，计算蛋白相对表达率。

1.2.6慢病毒的构建 从NCBI中获取RRS1基因的CDS全部序列，由上海吉凯公司合成慢病毒，选择编号为GV365的过表达质粒载体，载体元件为hU6-MCS-3FLAG-CMV-EGFP。为排除载体造成的影响，设置以乱序为核心序列的阴性对照，分别得到过表达慢病毒Lv-RRS1和阴性对照慢病毒。

1.2.7慢病毒转染SH-SY5Y细胞 根据慢病毒转染操作手册设计预实验，得出Lv-RRS1及其对照的MOI值为30，以含有Lv-RRS1和对照慢病毒的转染培养基分别培养SH-SY5Y细胞8 h，弃去转染培养基，更换含体积分数0.15胎牛血清的培养基继续培养48 h，得到转染后的Lv-RRS1组和对照组两组细胞，荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，选取80%以上转染的细胞进行后续实验。

1.2.8qPCR检测各转染组细胞mRNA表达水平将转染的细胞用Trizol法提取总RNA,检测RNA的浓度和纯度，反转录合成cDNA,条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存；配置qPCR反应体系，采用两步法进行扩增，条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸30 s,进行40次循环，采集每一次循环的荧光信号，每个样品设置3个复孔，比较转染组和对照组的相对表达丰度，实验重复3次。RRS1引物：正义链5′-CCCTACCGGACAC-CAGAGTAA-3′，反义链5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′；以GADPH为内参照，GAPDH的引物序列为：正义链5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反义链5′-AGGGGCCATCCACAG-TCTTC-3′。

1.2.9Western blot检测转染后各组细胞RRS1蛋白表达情况 将转染的各组细胞弃去培养基，分别用PBS洗1次，RIPA蛋白裂解法提取各组细胞总蛋白，方法同1.2.5。

1.2.10CCK-8检测转染细胞增殖能力 取转染的Lv-RRS1组和对照组细胞消化接种于96孔板，每组细胞5个复孔，每孔约3 000个细胞，待细胞贴壁后，更换为含有400 μmol/L MPP+的培养基每孔100 μL，继续培养48 h，方法同1.2.2。

1.2.11Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡情况 取转染的Lv-RRS1组和对照组细胞消化接种于6孔板，待细胞融合度达到70%时更换为含有400 μmol/L MPP+的培养基继续培养48 h，小心收集细胞，方法同1.2.4。

1.2.12Western blot检测细胞RRS1、P53、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平 细胞处理方法同1.2.11，RIPA裂解法提取总蛋白，其余步骤同1.2.5。

1.3 数据处理

2 结 果

2.1 细胞增殖活力检测结果

0、100、200、400 μmol/L MPP+组细胞增殖活力分别为1.00±0.00、0.89±0.01、0.79±0.02、0.62±0.01，随MPP+浓度增大细胞增殖活力明显下降，差异有统计学意义(F=95.63，P<0.05)。

2.2 SH-SY5Y细胞线粒体膜电位检测情况

荧光图片显示，随MPP+浓度增大，红色荧光强度逐渐减弱，绿色荧光强度逐渐增强，0、100、200、400 μmol/L MPP+组的红绿荧光强度比值分别为7.46±0.56、4.37±0.42、2.97±0.68和1.97±0.21，随着MPP+浓度增大，细胞红绿荧光强度比值显著下降(F=69.90，P<0.05)。见图1。

A、B：0 μmol/L MPP+组，C、D：100 μmol/L MPP+组，E、F：200 μmol/L MPP+组，G、H：400 μmol/L MPP+组。JC-1染色

2.3 MPP+对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

Annexin V-APC/PI双染法流式细胞仪检测48 h细胞凋亡情况，0、100、200和400 μmol/L MPP+组的细胞凋亡率分别为(2.30±0.57)%、(11.44±1.20)%、(19.70±1.27)%和(35.90±1.71)%，差异具有统计学意义(F=258.49，P<0.01)。见图2。

A、B、C、D分别为0、100、200、400 μmol/L MPP+组

2.4 SH-SY5Y细胞内RRS1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表达结果

与0 μmol/L MPP+组比较，200和400 μmol/L MPP+组SH-SY5Y细胞内P53蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(F=40.47，P<0.05)。与0 μmol/L MPP+组比较，100、200及400 μmol/L MPP+组细胞RRS1、Bcl-2蛋白的表达水平明显下降(F=28.44、42.43，P<0.05)，Bax蛋白表达水平明显升高(F=20.78，P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞中P53、Bax、Bcl-2和RRS1蛋白的表达

2.5 RRS1基因过表达后细胞RRS1 mRNA与蛋白的表达水平

Lv-RRS1组和对照组细胞RRS1 mRNA的表达水平分别为2.99±0.17、1.00±0.00，与对照组相比，Lv-RRS1组细胞RRS1 mRNA表达水平明显升高(t=15.59，P<0.01)。Lv-RRS1组和对照组细胞RRS1蛋白表达水平分别为1.81±0.11、1.03±0.13，与对照组相比，Lv-RRS1组细胞RRS1蛋白表达水平明显升高，差异均具有显著统计学意义(t=6.05，P<0.01)。

2.6 RRS1基因过表达后细胞增殖能力检测结果

Lv-RRS1组和对照组的细胞增殖活力分别为0.59±0.01、0.67±0.02，Lv-RRS1组的细胞活力明显高于对照组(t=4.76，P<0.01)。

2.7 流式细胞仪检测RRS1基因过表达和敲降后细胞凋亡情况

Lv-RRS1组和对照组SH-SY5Y细胞凋亡比例分别为(29.63±1.68)%、(38.00±1.16)%，Lv-RRS1组的细胞凋亡比例明显低于对照组(t=5.80，P<0.01)。

2.8 两组RRS1及凋亡相关蛋白检测结果

Lv-RRS1组RRS1、Bcl-2蛋白表达水平明显高于对照组(t=12.41、3.14，P<0.01)；P53蛋白和Bax蛋白表达水平明显低于对照组(t=5.20、4.77，P<0.05)。见表2。

表2 过表达RRS1基因后细胞RRS1、P53、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况

3 讨 论

PD是一种中老年常见的神经退行性疾病，由于中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡，黑质纹状体多巴胺能神经途径活性降低，胆碱能神经元活性亢进，引起患者震颤、肌强直、运动障碍，临床常用左旋多巴胺药物治疗或深部脑刺激来改善症状[15-16]，尚无方法治愈。核糖体生物生成障碍会引起P53依赖性细胞应激反应，称之为“核仁应激”[17]。核仁是rDNA转录和核糖体亚基组装的场所，当核仁处于应激时，核仁结构完整性受到破坏，一些核蛋白被释放进入核浆，如RPL5、RPL1、RPL23、RPS3以及RPS27a可以与鼠双微粒体2(MDM2)结合导致P53的活化和细胞衰老[18-20],P53可以通过促进促凋亡基因的转录，诱导线粒体通透性增加导致细胞的凋亡；相反，P53基因缺失对PD模型具有神经保护作用[21]，MDM2-P53通路是PD中的一个重要的信号途径[22-23]。

MDM2-P53信号通路一直是肿瘤研究的热点，现有研究表明RRS1蛋白可以在核仁中与核蛋白RPL11结合，当RRS1基因被沉默后，RPL11离开核仁进入核浆与E3泛素连接酶MDM2结合加强，P53蛋白失去抑制被激活[24-25]，引起细胞的凋亡，提示沉默RRS1可能通过P53信号途径引起细胞的凋亡。另外RRS1与亨廷顿病联系密切，亨廷顿病是一种显性遗传的神经系统退行性疾病，临床发现HD患者的脑组织RRS1基因的表达上调，在HD小鼠模型中发现RRS1基因在脑组织中表达明显升高，RRS1通过感知内质网应激过程，在异黏蛋白的作用下传递信号，参与亨廷顿病的发生以及发展[8,26]。然而RRS1与其他神经退行性疾病的关系研究较少，特别是RRS1与PD多巴胺能神经元异常凋亡的关系尚未见报道。

本研究以MPP+作为构建PD细胞模型的诱导剂，使用不同浓度的MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡，用CCK-8、JC-1和流式细胞术方法分析细胞增殖和凋亡情况，结果显示在0～400 μmol/L浓度区间的MPP+可以导致细胞线粒体膜电位的明显降低，处理48 h后细胞增殖活力下降，同时细胞凋亡率升高。Western blot检测MPP+处理细胞48 h后细胞凋亡相关蛋白和RRS1的相对表达量，结果发现，随着MPP+浓度增加，细胞P53、Bax表达升高，RRS1、Bcl-1表达降低，表明RRS1在MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡中表达降低。为进一步验证RRS1与细胞凋亡的相关性，通过慢病毒载体过表达RRS1基因的方式上调细胞中RRS1的蛋白表达量，再用400 μmol/L MPP+处理稳定转染的细胞48 h构建PD细胞模型，并对细胞增殖和凋亡情况进行再次检测，结果发现，与对照组相比，上调RRS1表达后SH-SY5Y细胞增殖活力升高，且细胞凋亡减少，表明RRS1参与并影响了细胞的凋亡过程。实验进一步对补偿RRS1表达后细胞凋亡相关蛋白P53、Bax和Bcl-1的相对表达量进行分析，结果显示，上调RRS1表达后，促凋亡蛋白P53和Bax表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，与对照组产生了截然相反的结果，提示RRS1可能是通过P53以及Bax/Bcl-2信号途径参与MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程。本研究为RRS1在PD细胞模型的作用提供了一定的理论基础，然而RRS1在PD模型细胞凋亡过程是否存在其他调控机制尚不清楚，其在体内实验的具体作用还需要进一步研究。

综上所述，MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的过程中，RRS1蛋白表达下降，RRS1可能通过影响凋亡相关因子P53、Bax和Bcl-2蛋白的表达参与MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。初步显示了RRS1在PD细胞模型中的作用及意义。