四个中国家系家族性甲状腺乳头状癌HABP2基因G534E位点突变分析

陶玉冰 赵世华 王斐

(青岛大学附属医院内分泌与代谢性疾病科,山东 青岛 266071)

近年来甲状腺癌的发病率逐年上升，已成为最常见的内分泌系统恶性肿瘤[1-2],其中甲状腺乳头状癌(PTC)作为其最常见的病理类型，近年来发病率不断增高[2-3]。而非髓性甲状腺癌(NMTC)占甲状腺癌的95%以上，5%～10%的NMTC患者具有家族史[4]，因此关于该病家族性遗传的研究逐渐引起重视。其中家族性NMTC(FNMTC)仅占NMTC的3%～10%，但其遗传倾向性在所有类型甲状腺癌中是最高的[5]，其中家族性甲状腺乳头状癌(FPTC)在FNMTC中占比最多，约占90%，其余为滤泡型甲状腺癌(包括Hurthle细胞型)[6]。对该病的发病机制现暂未形成统一定论，考虑遗传基因突变可能是FNMTC患者主要致病因素。近年来，已发现了多种可能的致病易感基因，期望通过功能分析进一步明确这些基因生物学功能，揭示FNMTC发病的分子机制[7]。目前研究发现透明质酸结合蛋白2(HABP2)基因G534E位点突变与FNMTC的发病可能存在一定关系[8-9]，但随后不同国家的相关研究结果并不一致。现有研究发现HABP2 基因G534E位点突变与FNMTC的易感性无关[10-14]，可能不同地区和种族该病的易感基因并不相同。同时我国国内相关的文献报道很少，因此本研究通过对我国4个FPTC家系先证者及其家族成员的相关临床资料进行分析，以期发现HABP2基因G534E位点的突变与我国FPTC发病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选取的我国4个FPTC家系先证者及其家族成员均不存在甲状腺疾病致病因素暴露史，4个家系的系谱如下：1号家系(图1A)先证者(1代患者1)是女性患者，其2个女儿(2代患者1、2)及儿子(2代患者3)均为PTC患者，其丈夫患有多结节性甲状腺肿。2号家系(图1B)姐姐为先证者(2代患者1)，其中1妹妹为PTC患者(2代患者2)，另1妹妹有多发性结节性甲状腺肿，其父母已故，生前无甲状腺相关疾病史，其弟弟经超声筛查正常。3号家系(图1C)母亲为先证者(1代患者1)，其2个女儿为PTC患者(2代患者5及2代患者6)，另1个女儿(2代患者3)患有多发结节性甲状腺肿，先证者的丈夫与2个女儿及1个孙子经甲状腺超声筛查均正常，女婿未采血样送检。4号家系(图1D)先证者(2代患者1)为第2代PTC女性患者，其母亲和弟弟分别患有甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症，但甲状腺超声筛查无异常，其女儿(3代患者1)为PTC患者且伴颈部淋巴结转移，其父亲已故，生前无甲状腺相关疾病病史，其丈夫、儿子及孙子经实验室检查及甲状腺超声筛查均正常，女婿未采集血样送检。见图1。

为男性，为女性，、为PTC患者，、为结节性甲状腺肿患者，、为已故者，为未采集血样者，为甲亢患者，为甲减患者，箭头所指为先证者

1.2 基因检测方法

采集PTC患者、多发性结节性甲状腺肿患者和正常亲属的静脉血各5 mL，分离白细胞提取DNA样本，利用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因，通过Sanger测序检测HABP2基因G534E位点的突变情况。PCR扩增的上游引物序列：5′-TGTCTCTGG-TTCACGAGGATG-3′，下游引物序列：5′-TGAGGTCCAGAAGACAGTACC-3′。PCR扩增步骤:将DNA样本初始加热至95 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。采用大型染料试剂(应用生物系统，加利福尼亚州，美国)和正向引物对PCR产物进行测序反应(图2)。采用ABI PRISM 3730自动遗传分析仪(应用生物系统，加利福尼亚州，美国)进行Sanger测序。

F1～F8:家系成员,F1、F4和F5是PTC患者，K1:阳性对照，H2O:阴性对照

2 结 果

PTC患者、多发性结节性甲状腺肿患者和患者亲属均未发现HABP2基因的阳性突变(图3)。

F1、F2、F5～7:家系成员,F1、F5为PTC患者，K1阳性对照

3 讨 论

现阶段甲状腺癌患者的总体发病率正在逐年升高[1-2]，FNMTC在甲状腺癌中总体上虽然占比不高，但其家族遗传性在所有甲状腺癌中是最高的[5]，故对于易感人群的筛查应引起足够重视。FNMTC多为FPTC，这与PTC在甲状腺癌中占绝大多数相一致[2-3]。对于FNMTC的发病特点及家族性，有研究表明，FNMTC患者的无病生存期明显短于散发患者[15]；FNMTC影响患者生存期的特征如下：起病较早，复发率更高，与散发病例相比较生存率更低等[16-17]。来自我国的研究也表明，双侧病变、多灶性、高中央淋巴结转移率是FNMTC的临床特征，且第2代患者的疾病诊断年龄早于第1代[18]。以上结论均提示，FNMTC相对于普通的散发PTC患者可能存在更高的侵袭性，更易导致预后不良。由于现阶段考虑遗传基因可能是FNMTC患者的主要致病因素，多个国家学者拟寻找出不同的基因位点突变以进一步阐述该病的发病机制，但均未得到广泛共识，故该病易感基因尚不明确，仍需多中心研究进行证实[6]。近几年来发现了多种不同的可能与该病相关的基因及其位点突变，如SRGAP1基因(12q14)、TITF-1/NKX2.1基因(14q13)、FOXE1基因(9q22.33)、HABP2基因(10q25.3)突变，同时还有很多未经证实的基因和位点突变等[19]。最新的研究显示NOP53可能是FNMTC的候选修饰基因位点[20]，MAPK-ERK和PI3K/AKT信号通路可能是导致肿瘤发生的通路[21-22]，但仍然需要大量的研究证实上述结论。由此可见，及时对患者家属进行周期性筛查，可能有助于早期识别患者，对于改善患者预后有极为重要的意义。

近年来相继有学者对HABP2基因G534E位点突变与FNMTC易感相关性进行了进一步研究。GARA等[8]报道HABP2基因G534E位点突变是FNMTC家系中的致病突变，HABP2可能为肿瘤抑制基因，而G534E位点突变可能导致肿瘤抑制功能丧失。ZHANG等[9]学者也得出了相似的结论，并进一步证实了HABP2基因G534E位点突变在FNMTC的几个独立的家族中发生，有14.0%是由HABP2引起，认为对HABP2基因G534E位点的检测将可能成为一种有助于识别高患病风险的FNMTC家系成员的措施。然而，后续研究则提出了相反的观点，波兰、意大利、澳大利亚、西班牙等国家的相关研究结果显示，HABP2基因G534E位点突变并不会增加这些国家的患者发生FNMTC的风险，即HABP2基因G534E位点并非FNMTC的致病突变[10-14]。ZHAO等[23]对中国12个PTC家系的HABP2 13外显子及其内含子区进行了测序，未发现HABP2突变。同时对217例散发PTC患者的检测结果提示，HABP2基因G534E位点突变可能与中国人群的FPTC发病无关。但是他们没有描述是否这些家系中有包括3个及以上的直系亲属是患有PTC。如果一个家族中只有2例PTC，据估计，其为散发PTC的概率为62%～69%，随着甲状腺癌发病率的增高，其概率可能更高[24]。此次在本研究检测的4个家系中，每个家系一级亲属中均有2个及以上确诊为PTC的患者，根据定义，考虑均为FNMTC家系，由于患者均诊断为PTC，可以将其定义为FPTC家系。且PTC患者及其家属并没有发现HABP2基因的阳性突变，提示HABP2基因G534E位点可能不是中国地区FPTC的易感突变位点。下一步还可以对患者及家属的其他基因有无突变情况进行进一步检测，以获得更多的数据资料，从而验证与FPTC相关的其他易感基因。

总之，本研究结果显示，HABP2基因突变可能不是我国FPTC易感基因，需要进一步验证其他基因的突变情况。由于FNMTC的侵袭性较高，为了明确易感基因，可能需要进一步寻找FNMTC的其他相关基因，同时需要对多中心大数据进一步分析确定，以利于提前筛查、早期诊断，以改善患者预后。