黄芪多糖抑制多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、迁移和侵袭

李清平，刘会群，蔡 萼*

(湖北省荆门市第二人民医院 1.病理科； 2.检验科, 湖北 荆门 448000)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种起源于B细胞的恶性克隆性浆细胞疾病，其发病率在血液肿瘤疾病中排名第3位[1]。近年来，MM的发病率呈增长趋势，并且患者年龄呈年轻化。随着硼替佐米、雷利度胺等新药的应用、干细胞移植技术的成熟以及化疗方案的改善，该疾病的治疗效果有了很大的提高，但并不能完全治愈[2]。所以，研究新型的治疗药物提高MM的治疗疗效具有重要意义。黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是中国传统中药黄芪的主要活性成分，具有保护造血系统、抗病毒、抗肿瘤等多方面的药理功效[3-4]。APS通过抑制基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表达抑制视网膜母细胞瘤RB44细胞的侵袭能力[5]。APS可能通过调节PD-1和PD-Ls分子的表达及相互作用抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生长[6]。目前，APS对MM细胞生物学行为的影响还未见报道。本研究通过探讨APS对MM细胞U266增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制，以期为该疾病治疗药物的研制提供一定的新思路或新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂

多发性骨髓瘤细胞系U266(上海中美合资博慧斯生物医药科技有限公司)；黄芪多糖APS(南京景竹生物技术有限公司，纯度98%)；胎牛血清(Hyclone公司)；RPMI 1640培养基(Gibco公司)；CCK-8(日本同仁公司)，Matrigel基质胶(Corning公司)；蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒和 Western blot常规试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和p21抗体(Santa Cruz公司)；B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体(Dako公司)；肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)抗体(上海诚凛生物科技有限公司)；E-cadherin、MMP-2抗体和辣根过氧化酶标记的二抗IgG(北京中杉生物有限公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：从液氮罐中取出装有U266细胞的冻存管，放入37 ℃水浴中，用镊子夹着冻存管不停摇动使其在1 min内快速溶解。转移至15 mL离心管中，加入适量预冷的PBS清洗细胞，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基转移至培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2、97%湿度的培养箱中培养。根据细胞增殖和培养基颜色变化，每2～3 d更换1次新鲜的培养基。取对数增殖期的U266细胞分组处理。APS组：APS终浓度分别为6、 8和10 mg/mL[7]；对照组(Con组)：培养基；阴性对照组：无细胞，只加培养基。APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6组：转染TRAF6过表达质粒后，8 mg/mL的APS作用U266细胞；APS 8 mg/mL+pcDNA3.1组：转染空质粒后，8 mg/mL的APS作用U266细胞。转染具体操作步骤参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：U266细胞调整为2.5×104个/mL，每孔100 μL单细胞悬液接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO2、97%湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后，按照1.2.1分组处理后分别培养24、48和72 h，每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，培养箱中继续孵育2 h，于全自动酶标仪450 nm波长处测定吸光度值(A)。细胞增殖抑制率(%)=[1-(AAPS组-A对照组)/(A阴性对照组-A对照组)]×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡：细胞分组处理后，收集细胞，PBS清洗。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明，加入400 μL结合缓冲液重悬细胞，再依次加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭：细胞迁移实验：细胞分组处理后，收集细胞，PBS清洗。用不含血清的培养基重悬，取200 μL细胞悬液(含1×105个细胞)加入至Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基。培养24 h后，对穿过小室的细胞数量进行计数。细胞侵袭实验：使用不含血清的培养基稀释Matrigel基质胶，铺设在Transwell小室的上室，凝固后，再加入细胞悬液。其余操作与细胞迁移实验相同。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达：取处理后的U266细胞，PBS溶液清洗后，加入不含蛋白酶的RIPA裂解液。置于冰上充分裂解30 min后，4 ℃、12 000×g离心15 min，上清液即为蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。取适量蛋白，加入上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性。取变性后的蛋白质，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将分离的蛋白电转移至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶在室温条件下进行封闭2 h。然后，加入稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜。PBS溶液清洗后，加入辣根过氧化酶标记的二抗IgG，室温条件孵育1 h。PBS溶液清洗后加入ECL显影液，避光显影。使用凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白条带吸光度值。以GAPDH为内参，目的蛋白的表达水平以目的蛋白与内参GAPDH条带吸光度值的比值表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的APS对U266细胞增殖的影响

与对照组比，APS组抑制率显著升高(P<0.05)，且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)(图1A)；U266细胞中cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05)，p21蛋白表达水平升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)(图1B，C)。此外，浓度为8 mg/mL的APS作用U266细胞48 h时，对U266细胞的抑制率约为50%，因此选择8 mg/mL的APS作用U266细胞48 h进行后续试验。

2.2 APS对U266细胞凋亡的影响

与对照组相比，APS 8 mg/mL组U266细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)(图2)。

2.3 APS对U266细胞迁移、侵袭的影响

与对照组比，APS 8mg/mL组U266细胞迁移和侵袭数量显著减少(P<0.05)(图3A)，E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)，MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05)(图3B，C)。

2.4 APS对U266细胞中TRAF6表达的影响

与对照组相比，APS 8mg/mL组U266细胞中TRAF6蛋白表达显著降低(P<0.05)(图4)。

A,C.effect of APS on the expression of U266 cell proliferation-related proteins; B.effect of APS on the inhibition rate of U266 cells; *P<0.05 compared with the Con group; #P<0.05 compared with the APS 6 mg/mL group; △P<0.05 compared with the APS 8 mg/mL group

A,B.effect of APS on E-cadherin and E-cadherin protein expression in U266 cells; C.effect of APS on the number of migration and invasive cells; *P<0.05 compared with the Con group

*P<0.05 compared with the Con group图4 APS对U266细胞中TRAF6表达的影响Fig 4 Effect of APS on the expression of TRAF6

2.5 过表达TRAF6降低了APS对U266细胞增殖、凋亡的影响

分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-TRAF6至U266细胞，然后使用8 mg/mL的APS作用转染后的细胞，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6组U266细胞中TRAF6蛋白表达显著高于APS 8 mg/mL+pcDNA3.1组(P<0.05)。培养相同的时间，与APS 8 mg/mL+pcDNA3.1组比，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6组U266细胞抑制率显著降低(P<0.05)(图5A)，凋亡率显著降低(P<0.05)(图5B)，cyclin D1和Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，p21和Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图5C，D)。

2.6 过表达TRAF6降低了APS对U266细胞迁移、侵袭的影响

与APS 8 mg/mL+pcDNA3.1组比，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6组U266细胞迁移和侵袭数量显著增加(P<0.05)(图6A)，E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图6B)，MMP-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图6B，C)。

3 讨论

MM的病情发展较为迅速，尚不能完全治愈，患者中位生存期为3～4年[8]。在骨髓瘤的治疗中，中药可以作为化疗辅助治疗的药物。目前，已有研究显示，黄芩苷[9]、三七总皂苷[10]等中药活性成分可有效的影响骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的恶性生物学行为。作为中药黄芪的主要有效活性成分，APS具有抗肿瘤活性。如APS可能通过降低P65的转录活性抑制人肺癌细胞系A549增殖，抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长[11]。APS能够抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖，诱导其凋亡，并能够通过调节自噬增强HeLa细胞对顺铂的敏感性[12]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究结果显示，APS能够提高骨髓瘤细胞U266抑制率，且具有剂量和时间依赖性，减少U266细胞迁移和侵袭数量，提高U266细胞凋亡率， 并下调cyclin D1、Bcl-2、MMP-2和TRAF6蛋白表达，上调p21、Bax、和E-cadherin蛋白表达，表明APS能够抑制U266细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡，提示APS具有开发为骨髓瘤治疗药物的潜力。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是肿瘤坏死因子受体家族成员之一，可调控成骨细胞分化、神经系统发育等生命过程，在疾病的发生发展过程中发挥重要作用。小白菊内酯通过与TRAF6直接结合抑制NF-κB信号通路的激活，从而抑制多发性骨髓瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[13]。骨髓瘤细胞中TRAF6表达水平显著升高，沉默TRAF6表达可能通过影响NF-κB等信号通路抑制骨髓瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡[14]。本研究结果显示，APS可降低骨髓瘤细胞U266中的TRAF6蛋白表达，过表达TRAF6逆转了APS对U266细胞增殖、迁移和侵袭以及凋亡的影响，提示APS可能通过下调U266细胞中TRAF6表达抑制其增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。

A,B.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on U266 cells proliferation and apoptosis-related protein expression; C.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on the apoptosis rate of U266 cells;D.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on the inhibition rate of U266 cells; *P<0.05 compared with Con group; #P<0.05 compared with APS 8mg/ml+pcDNA3.1 group

A,B.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on E-cadherin and E-cadherin protein expression in U266 cells; C.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on U266 cell migration and invasion cells; *P<0.05 compared with Con group; #P<0.05 compared with APS 8 mg/mL+pcDNA3.1 group

综上所述，APS能够抑制骨髓瘤细胞U266的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导其凋亡，其可能通过下调TRAF6表达发挥作用，是治疗骨髓瘤的潜在药物。