改良保存液处理红细胞对糖尿病小鼠创面愈合的影响

卫含伟，朱娜娜，王 欢，刘小倩，段立双，周 循，郭建荣*

(1.皖南医学院研究生院，安徽 芜湖 241002； 2.海军军医大学附属公利医院 麻醉科，上海 200135)

在所有接受外科手术的患者中，有8%～10%为糖尿病患者[1]，伤口愈合不良作为糖尿病的主要并发症之一，已成为糖尿病患者术后恢复的关注焦点。自体输血已成为现代医学关注的热点和未来医学发展的方向，自体输血不仅可以避免异体输血带来的风险和并发症，同时也可缓解血源短缺的现状。有研究指出自体输血(autologous blood transfusion)可作为伤口愈合的主要治疗突破[2]；所以采用适当方法处理和保存糖尿病患者的血液，保持红细胞(red blood cell，RBC)离体后的正常形态及功能，避免因RBC贮存损伤而影响糖尿病患者的伤口愈合至关重要。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是HIF-1转录因子的亚基，研究显示HIF-1α在创面愈合过程中具有一定作用[3]，本研究主要模拟临床自体输血，观察不同保存液处理后糖尿病小鼠RBC功能的改变，及其回输后对糖尿病小鼠伤口愈合的影响，并初步探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SPF级雄性昆明小鼠30只，体质量26～30 g (中国科学院上海实验动物中心，SKD111001)。

1.1.2 主要试剂:ELISA试剂盒、山羊抗兔IgG抗体、兔血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、HIF-1α、Ⅰ抗、Ⅱ抗、β-肌动蛋白、MEK、p-MEK、 ERK1/2、 p-ERK1/2、PI3K、p-PI3K、 AKT 和p-AKT(Abcam公司)；ECL荧光检测试剂盒(上海古朵生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立:通过连续5 d腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。采用随机数字表法将小鼠分为献血组和实验组，实验组小鼠随机分为标准组(standard)和改良组(improvement)。

1.2.2 血液的采集及保存:采集建模成功的献血组小鼠全血[4]，分别用改良保存液和标准保存液放入4 ℃～6 ℃的冰箱内进行保存，保存液[5]配方主要成分有改良保存液和标准保存液。改良的血液保存液：2 mmol/L腺嘌呤、55.5 mmol/L糖、55 mmol/L甘露醇、26 mmol/L NaCl和12 mmol/L Na2HPO3，pH值为6.5。标准血液保存液：2.2 mmol/L腺嘌呤、110 mmol/L糖、70.1 mmol/L氯化钠、20 mmol/L磷酸氢二钠和12 mmol/L柠檬酸组成，pH值为5.8。

1.2.3 红细胞功能的检测:在血液保存的第7、14、21和28天，根据试剂盒的使用说明，用分光光度仪检测微量游离血红蛋白(free hemoglobin，fHb)，COBAS-B-123全自动血气分析仪及电解质分析仪检测血液样品中P50、血pH值、RCD，ELISA检测2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)含量。

1.2.4 伤口模型的建立及取材:血液保存的第7天，异氟烷麻醉，用剪刀将小鼠背部皮肤的毛发剃去、消毒，制作直径为2 cm表皮开放伤口模型，分别输注保存7 d的改良保存血和标准保存血，输注后连续观察和测量伤口，持续14 d。第14天异氟烷麻醉小鼠后，处死，收集小鼠创面皮肤组织进行后续实验。

1.2.5 创口形态学的观察:计算机分析数码相机拍摄图像，按公式计算创面愈合率。采用常规HE 染色，观察创口的组织形态学变化。

1.2.6 免疫组织化学观察:将切片脱蜡、水化后，滴加1%的H2O2，室温孵育10 min，去除内源性过氧化物酶，随后微波法抗原修复。加入兔血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF))或HIF-1α，室温下孵育60 min，蒸馏水冲洗，置入PBS溶液中。生物标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶3 000)37 ℃下孵育40 min，用蒸馏水冲洗，然后放置在PBS溶液中。应用DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。

1.2.7 Masson染色观察:切片脱蜡、水化后，苏木精染色10 min，充分水洗，用1%的盐酸-乙醇进行1～3 s的分化，然后用水冲洗15 min，切片放入促蓝液中致切片变蓝，清水冲洗，将切片放在立春红酸性复红液中浸泡10 min，用2%的冰醋酸溶液水洗片刻，1%的磷钼酸溶液进行3～5 min分化，苯胺蓝染色5 min后浸泡在0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察并获得图像。

1.2.8 Western blot检测蛋白: 皮肤组织用PBS洗涤两次，加入裂解缓冲液，在涡流混合器中摇动，在4 ℃下、12 000 r/min离心30 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离，转膜。加入Ⅰ抗，室温孵育2 h，洗涤后加入Ⅱ抗，室温孵育1 h。使用电化学发光法(ECL)显示条带， ECL荧光检测试剂盒(BB-3501)，使用Bio-Rad图像分析系统采集图像，然后通过图像J软件进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

建模期间2只小鼠死亡，3只未建模成功。

2.1 储存RBC功能

改良组血浆 fHb含量降低，P50、pH、2,3-DPG和RCD显著升高(P<0.05)(图1A～E)。

A.fHb content; B.P50 oxygen pressure; C.blood pH; D.level of 2, 3-DPG; E.RCD value; *P<0.05 compared with the standard group; #P< 0.05 compared with improvement (7 days)

2.2 糖尿病小鼠伤口愈合能力

与标准组比较，改良组小鼠术后第7和14天皮肤创面面积显著下降(P<0.05)(图2A,B)。改良组小鼠术后第14天皮肤组织和血管面积显著增加(P<0.05)(图2C～E)。与标准组比较，改良组小鼠皮肤胶原纤维的表达和纤维化程度在手术后14 d升高(图2F)。

A.wound healing was observed on the 7th and 14th day after operation, with blood transfusion in which the bloods were preserved in different preservation solutions; B.quantification and statistical analysis of wound healing at 0, 1, 4, 7 and 14 days after operation; C.HE staining for wound healing of the skin tissues 14 days after operation(scale bar=25/50 μm); D.quantification and statistical analysis of wound healing granular tissue 14 days after operation; E.quantification and statistical analysis of angiosomes 14 days after operation; F.masson staining of wound healing tissues (bar = 50 μm); *P<0.05 compared with the standard group

A.in situ detection of HIF-1α by immunohistochemistry(scar bar=25 μm); B.quantification and statistical analysis of the HIF-1α expression in wound tissues; C.level of VEGF by immunohistochemistry; D.quantification and statistical analysis of level of VEGF; E.level of EGF by immunohistochemistry; F.quantification and statistical analysis of level of EGF; *P<0.05 compared with the standard group

2.3 糖尿病小鼠皮肤中HIF-1α、VEGF和EGF及HIF-1α相关蛋白的表达

与标准组比较，改良组小鼠皮肤组织中HIF-1α、VEGF和EGF水平显著升高(P<0.05)(图3A～F)。改良组小鼠皮肤组织中的PI3K/Akt和MEK/ERK表达增加，p-PI3K、p-AKT、p-MEK和p-ERK的蛋白表达水平均显著高于标准组(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with the standard group图4 两组糖尿病小鼠HIF-1α相关蛋白表达情况

3 讨论

创伤愈合是多种细胞、细胞因子及细胞外基质和可溶性介质之间相互作用和高度协调的一种组织损伤的再生反应过程，局部或全身使用促血管生成分子可以促进血管生成和伤口愈合[6]。糖尿病伤口愈合的机制比较复杂，糖尿病患者的伤口愈合障碍可能与其RBC功能异常有关[7]。RBC功能异常导致局部组织缺血缺氧，其变形能力的降低，导致RBC对中性炎性细胞浸润、细胞外基质增生的病理生理学改变的抑制作用减弱，对糖尿病并发症的发生亦起到了推波助澜的作用，由此可认为改善糖尿病患者RBC形态功能，可能会促进糖尿病患者伤口愈合。

本实验结果表明，同标准液保存RBC比较，改良血液RBC与氧的亲和力增加，fHb降低，RBC变形能力增强，而且通过观察实验组小鼠14 d伤口愈合程度发现，输注改良RBC小鼠伤口愈合显著增强，证明功能改善后的RBC可促进糖尿病小鼠伤口愈合。高血糖下皮肤成纤维细胞和内皮细胞中HIF-1α水平降低是慢性伤口愈合不良的标志[8]，HIF-1α可通过激活Erk/MAPK 或PI3K/Akt 信号通路上调与伤口愈合密切相关蛋白的表达，其中包括与血管新生相关的VEGF 受体[9]，VEGF是血管生成的主要刺激因子，又可激活PI3K/Akt通路，结合VEGF受体介导血管生成[10]。高血糖能够抑制HIF-1α的蛋白水平及其转录功能这一推断已得到证实[11]，在高糖或糖尿病环境下，抑制HIF-1α的具体分子机制不清，糖尿病患者RBC的功能异常可降低HIF-1α 水平和活性[12]。本研究中，通过改良保存液保存的血液，其RBC功能显著改善，改良组创口皮肤组织中HIF-1α、VEGF、EGF的表达水平显著提高，HIF-1α通路有关的蛋白表达水平也显著提高。因此可以认为改良保存RBC可能通过改善RBC的功能，激活HIF-1α通路促进伤口愈合，但是本实验只涉及到小鼠体内实验，且未对小鼠HIF-1α基因沉默对照进行实验研究，仍需要进一步实验进行验证。

综上所述，改良保存液可显著改善红细胞的携氧量及维持其变形性，进而促进糖尿病小鼠伤口的愈合，其机制可能与激活HIF-1α信号通路有关。