miR-93在胃癌患者血清中的表达变化及与临床病理特征和预后的关系

张敏 庄伟 王敏 徐凤玲 任传涛

胃癌是全球范围内发病率较高的一种消化道恶性肿瘤，发病与环境、饮食等因素有关，但至今其具体发病机制尚不明确。由于缺乏早期特异性表现，多数胃癌患者就诊时己进入中晚期，患者预后往往较差[1,2]。因此，寻找早期筛查胃癌的生物学标志物，对于改善胃癌预后具有重要意义。有研究表明，miR-93参与了结肠癌等恶性肿瘤的发生发展[3]。相关文献报道，miR-93在子宫内膜癌、乳腺癌等组织中起到促癌基因的作用，但目前有关miR-93在胃癌患者血清中表达变化及其与患者临床病理特征和预后关系的研究甚少[4,5]。因此，本研究采用实时荧光定量(qRT-PCR)检测胃癌患者血清中的miR-93水平，并分析探讨miR-93与胃癌患者临床病理特征及预后的关系，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年10月至2016年5月在我院接受手术治疗的胃癌患者88例，其中男59例，女29例;平均年龄(60.8±15.7)岁。选取同期来我院体检的60例健康人为对照组，其中男41例，女19例;平均年龄(59.2±19.1)岁。2组年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①有明确的术后病理诊断结果；②近期内未曾接受过放化疗或手术治疗者；③病例资料及随访资料完整者；④患者均已签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤者；②合并有炎症内分泌代谢疾病及肝肾功能疾病者。

1.3 主要试剂及仪器 miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均购自德国QIAGEN公司；LightCycle 96 荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；超低温冰箱购自美国Thermo Scientific公司。miR-93及内参U6引物购自广州锐博生物公司。

1.4 检测方法 受试者空腹采集静脉血5 ml,3 500 r/min离心30 min，将上层上清液转移至Eppendorf (EP)管中，-80℃低温冰箱保存备用。严格按照miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒说明书提取总RNA，分光光度仪检测总RNA的纯度和浓度。根据逆转录试剂盒miScript II RT Kit说明书操作逆转录合成cDNA。取cDNA应用miScript SYBR Green PCR Kit进行实时定量PCR 反应。引物序列：miR-93上游引物5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物5’- ACGUGACACGUUCGGAGAAATT-3’；U6上游引物5’- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’- CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃ 1 min，扩增45个循环。以U6为参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-93的相对表达量。

1.5 随访 采用电话或门诊的方式每3个月随访记录患者的生存情况，随访截止至2018年12月止。

2 结果

2.1 2组血清中miR-93的检测 qRT-PCR结果显示，胃癌组血清中miR-93相对表达水平为(4.25±0.25)2-ΔΔct明显高于对照组(0.97±0.06)2-ΔΔct，差异有统计学意义(t=99.590,P<0.05)。

2.2 miR-93表达变化与胃癌临床病理特征的关系 以胃癌患者血清miR-93表达水平的中位值为截断值，将患者分为miR-93高表达组44例和mi-93低表达组44例，统计分析显示胃癌患者血清miR-93表达与肿瘤直径、病理分化程度、TNM分期、淋巴结转移及浸润深度等有关(P<0.05)，而与年龄、性别等无关(P>0.05)。见表1。

表1 miR-93表达变化与GC临床病理特征的关系 例

2.3 血清miR-93对胃癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，miR-93诊断胃癌时ROC曲线下面积(AUC)为0.975(95% CI为0.960～0.991，P<0.05)。最佳诊断值为1.597时，灵敏度为93.7%，特异度为92.4%。见图1。

图1 血清miR-93诊断胃癌的ROC曲线

2.4 回归分析 Cox 回归分析结果显示：淋巴结转移及miR-93表达是影响胃癌患者预后的独立因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响胃癌患者预后的Cox 回归分析

2.5 血清miR-93水平对胃癌预后的判断价值 Kaplan-Meier生存分析结果显示，血清miR-93高表达组胃癌患者总生存率明显低于血清miR-93低表达组胃癌患者(P<0.05)。见图2。

图2 血清miR-93高、低表达组胃癌患者生存曲线

3 讨论

胃癌是一种好发于老年人的恶性肿瘤，该病起病隐匿，多数患者发现时已进入进展期或晚期，为治疗增加了一定的难度。临床治疗胃癌通常以化疗、手术治疗为主，但患者5年生存率仍不理想[6,7]，因此及早发现胃癌，对于提高患者生存率意义重大。有研究表明，作为小分子非编码RNA的miRNA可以参与细胞生长、分化及多种肿瘤的进展过程[8,9]。miRNA是一类在广泛存在于人体中的小片段非编码 RNA，不易被酶降解，可在血清中稳定存在，且不易受到外界环境因素的影响，因此，临床中可将血清中异常表达的miRNA作为诊断肿瘤及预测预后的分子标记物。目前已经发现许多血清中异常表达的miRNA可以作为恶性肿瘤早期诊断及预后判断的分子标志物。陈剑等[10]研究发现miR-183在食管鳞癌患者血清中表达明显增高，并且与肿瘤的TNM分期有关，血清miR-183能够明显提高食管鳞癌的诊断效率。在胰腺癌患者血清中发现miR-196a和miR-210表达异常增高，并且与胰腺癌患者的生存时间相关[11]。王丹等[12]发现肝细胞癌患者血清中miR-187-3p可能成为早期诊断及预后判断特异敏感的生物标志物。

目前国内外学者对胃癌的研究中也发现了许多血清中异常表达的miRNA。王静等[13]发现血清中miR-223对胃癌有着良好的早期诊断效能。陈卿奇等[14]研究发现胃癌患者血清miR-132及miR-183异常高表达，可作为胃癌早期诊断的新型肿瘤标记物。但至今尚未发现令人满意的胃癌血清miRNA预测标志物[15]。miR-93属于miR-106b～25 miRNA簇重要成员，研究发现miR-93在消化道恶性肿瘤组织中表达异常，可能与肿瘤的发生进展有关[16]。本研究结果显示：胃癌患者血清中miR-93水平较对照组明显升高，提示miR-93在胃癌的发生发展中可能起着癌基因的作用。有研究表明miR-93作为癌基因发挥作用，能够促进细胞周期的G1/S期转换从而促进癌细胞的生长[17]。但另有研究发现：miR-93在神经母细胞瘤中表达降低，作为抑癌基因发挥作用，能够抑制癌细胞的迁移能力和侵袭潜能[18]。原因可能为：miR-93在不同类型的肿瘤中通过不同的下游分子靶向通路起作用，存在明显的异质性。Li等[19]也发现miR-93在胃癌组织和细胞系中表达升高，能够促进胃癌细胞的恶性生物学行为，但是未对胃癌患者血清中miR-93表达水平进行研究。

本研究结果进一步显示，随着肿瘤直径扩大、病理分化程度降低、TNM分期进展及淋巴结转移，血清miR-93表达水平则随之升高，说明 miR-93在胃癌中可能发挥癌基因的作用。本研究结果还显示血清miR-93诊断胃癌时ROC曲线下面积(AUC)为0.975，通常AUC>0.9则表明诊断效能较高，提示miR-93对于早期胃癌的早期诊断价值较高，可作为胃癌早期诊断的敏感生物学指标。本研究曾指出，在非小细胞癌组织中，miR-93表达显著上调，高表达患者5年总生存率低[18]。本研究结果也显示，与血清miR-93低表达组比较，血清miR-93高表达组胃癌患者预后较差。Cox 回归分析结果显示：淋巴结转移及miR-93表达水平是影响胃癌患者预后的独立因素。提示血清miR-93高表达与胃癌患者的不良预后密切相关。

综上所述，胃癌患者血清中miR-93异常高表达，血清中miR-93可以作为早期诊断胃癌的血清生物学标志物，且可作为胃癌患者预后的预测指标。