核桃青皮提取物调控IL-6/STAT3抑制胃癌细胞增殖和迁移的作用研究

高杨 李盛涛 郝文伟

胃癌是我国第二大恶性肿瘤[1]，我国胃癌发病率高、转移率较高、死亡率较高，而且早诊断率低、根治切除率低，放化疗和手术是主要的治疗手段[2]。因此寻找有效的药物治疗方法尤为重要。研究表明中医药能够多靶位、多环节抑制胃癌的发生发展与转移[3]，紫杉类药物是治疗胃癌的新高效药，与其他药物联合治疗毒副作用小[2]。用参苓白术散加减配合治疗化疗胃癌术后患者可减轻化疗药物不良反应[4]；养正消积胶囊能有效杀死癌细胞、提高机体免疫力、增强化疗药物敏感性等多种功能[5]。桃青皮提取物具有很强的抗菌和抗真菌效果[6]；能抑制体外肿瘤细胞的增殖，直接杀死肿瘤细胞[7,8]；可明显抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]；可抑制Hela细胞增殖上调caspase-3蛋白表达[10]。本实验研究核桃青皮提取物对胃癌细胞增殖和转移的影响，且分析核桃青皮提取物和IL-6/STAT3之间关系。为胃癌的预防和药物治疗提供实验依据以及新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞 胃癌BGC-823细胞株胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 材料与试剂 胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、 qPCR SYBR® Green Mix购自Takala生物公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、蛋白提取试剂盒、BCA 试剂盒均购自上海碧云天公司；细胞板、酶标仪购自赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃青皮提取液制备:参考文献[8]，核桃青皮用95%的乙醇萃取4次，风干得到的微细粉即为核桃青皮粗提取物。

1.3.2 细胞培养:胃癌BGC-823细胞常规培养于含10 % FBS的RPMI 1640培养基，置于37℃，含5% CO2恒温箱培养。每2～3天传代一次。

1.3.3 细胞分组:取对数生长的BGC-823细胞分别消化接种于96孔板(5×103个/孔)培养到细胞贴壁后换成相应浓度的核桃青皮提取物培养液或IL-6，再培养48 h。实验分为核桃青皮提取物0 μg/ml组、核桃青皮提取物10 μg/ml组、核桃青皮提取物20 μg/ml组、核桃青皮提取物40 μg/ml组、核桃青皮提取物80 μg/ml组、对照组(无核桃青皮提取物)、核桃青皮提取物组(浓度20 μg/ml)、核桃青皮提取物+IL-6组(核桃青皮提取物浓度20 μg/ml、IL-6浓度100 ng/ml)。

1.3.4 MTT法检测细胞增殖:取对数生长期的核桃青皮提取物0 μg/ml组、核桃青皮提取物10 μg/ml组、核桃青皮提取物20 μg/ml组、核桃青皮提取物40 μg/ml组、核桃青皮提取物80 μg/ml组、对照组、核桃青皮提取物组、核桃青皮提取物+IL-6组BGC-823细胞分别消化接种于96孔板(5×103个/孔)培养48 h后加入20 μl MMT，继续培养4 h后去上清，加入150 μl的DMSO，震荡混匀，在酶标仪测定各孔490 nm波长处吸光度(A)值，细胞增殖抑制率= (空白组A值-处理组A值)/空白组A值×100%。

1.3.5 Transwell法检测细胞迁移侵袭:参考文献[11]，取对数生长期对照组、核桃青皮提取物组、核桃青皮提取物+IL-6组BGC-823细胞分别消化接种于96孔板(5×103个/孔)培养48 h后，配制不含血清的细胞培养液，饥饿去血清后取适量悬液加入Transwell小室上层(3×105个/孔)，下室加含有趋化因子的培养基，继续培养48 h。用棉签擦去上室内的细胞，再用0.1%的结晶紫染色，细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入基质胶Matrigel，凝固后接种BGC-823细胞，之后和细胞迁移操作相同。显镜下随机选取5个视野进行细胞的观察、计数。

1.3.6 qRT-PCR分析 MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平:按照Trizol说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照 qPCR SYBR® Green Mix说明书进行qRT-PCR方法扩增。循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.3.7 蛋白免疫印迹(western blot，WB)检测蛋白表达:收集稳定表达对照组、核桃青皮提取物组的BGC-823细胞，提取细胞中总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白总量。各组蛋白上样量60 μg，SDS-PAGE后，经电转将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，加入各自的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入相对应的二抗，室温孵育2 h。PBS洗涤3次，每次10 min，然后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片进行拍照分析，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和 β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

2 结果

2.1 不同浓度核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞增殖的影响 MTT法检测结果显示，不同浓度核桃青皮提取物处理胃癌BGC-823细胞后，48 h时胃癌BGC-823细胞的抑制率随着核桃青皮提取物的浓度升高而逐渐显著升高(P< 0.05)。可见，核桃青皮提取物可抑制胃癌BGC-823细胞增殖。见表1。

表1 不同浓度核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

2.2 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞迁移侵袭的影响 Transwell 法检测结果显示，相较于对照组，核桃青皮提取物组胃癌BGC-823细胞迁移和侵袭数量显著降低(P< 0.05)。可见，核桃青皮提取物可抑制胃癌BGC-823细胞迁移和侵袭。见图1，表2。

图1 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞迁移(A)侵袭(B)的影响(结晶紫染色×400)

表2 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞迁移侵袭的影响 n=3,个,

2.3 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞迁移侵袭相关基因表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，相较于对照组，核桃青皮提取物组胃癌BGC-823细胞迁移侵袭相关基因MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平显著降低(P< 0.05)。Western Blot检测结果显示，相较于对照组，核桃青皮提取物组胃癌BGC-823细胞迁移侵袭相关基因MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著降低(P< 0.05)。可见，核桃青皮提取物抑制MMP-2、MMP-9的表达。见图2，表3。

图2 MMP-2、MMP-9蛋白表达

表3 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响n=3,个,

2.4 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞中IL-6/STAT3表达的影响 Western Blot检测结果显示，相较于对照组，核桃青皮提取物组胃癌BGC-823细胞中IL-6和p-STAT3蛋白表达水平显著降低(P< 0.05)。可见，核桃青皮提取物抑制IL-6和p-STAT3的表达。见图3，表4。

图3 IL-6、p-STAT3蛋白表达

表4 核桃青皮提取物对胃癌BGC-823细胞中IL-6/STAT3表达的影响n=3,个,

2.5 IL-6刺激后逆转了核桃青皮提取物对BGC-823细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 MTT法和Transwell 法检测结果显示，相较于对照组，核桃青皮提取物组胃癌BGC-823细胞抑制率显著升高；细胞迁移和侵袭数量显著降低(P< 0.05)。相较于核桃青皮提取物组，核桃青皮提取物+IL-6组胃癌BGC-823细胞抑制率显著降低；细胞迁移和侵袭数量显著升高(P< 0.05)。可见，IL-6刺激后逆转了核桃青皮提取物对BGC-823细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。见图4，表5。

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，严重影响人们身心健康，中医药疗法是其常用的治疗手段[12]。中西医结合治疗将是一个必然的发展方向[13]。核桃青皮富含胡桃醌、多酚、黄酮、色素、多糖等多种生物活性成分，具有杀菌消炎、抗肿瘤等作用[14]。研究表明，胡桃醌可诱导肿瘤细胞凋亡及引起细胞G2/M期阻滞，抗肿瘤效果好[15]。核桃青皮提取物对多种癌症都有一定抑制作用，或直接作用细胞，或阻碍细胞周期，或抑制PI3K/Akt信号通路等。其主要成份胡桃醌直接杀伤人肝癌肿瘤细胞[16]；青龙衣多糖在体外直接杀伤人结肠癌细胞，但体内其抗肿瘤机制或与PI3K/Akt信号通路相关[17]。核桃青皮粗提物阻滞食管癌细胞G0/G1期[18]；核桃青皮粗提物抑制小鼠肺癌细胞生长[19]；复方青龙衣胶囊使胃癌细胞停滞在G1/S期达到抗肿瘤作用[20]。反左金丸水提物对胃癌的生长有明显的抑制作用并可诱导其凋亡[21]；青龙衣含药血清抑制胃癌细胞的增殖[22]。白藜芦醇能通过下调由IL6引起的p-JAK2、p-STAT3的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用[23]。辛温通阳中药葱白[24]、桂枝提取物[25]等多种提取物均可以影响IL-6/STAT3信号通路中相关的细胞因子的表达，具有防治AS的作用。薏苡仁提取物能有效抑制C57小鼠肝癌模型的肿瘤生长，能降低血清IL-6水平[26]。

图4 IL-6刺激后逆转了核桃青皮提取物对BGC-823细胞迁移(A)、侵袭(B)的抑制作用(结晶紫染色×400)

表5 IL-6刺激后逆转了核桃青皮提取物对BGC-823细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 n=3,个,

IL-6是一类由细胞产生又在细胞间作用的细胞因子[27]，在肿瘤的形成过程中有重要作用，能诱导STAT3活化，激活IL- 6/ STAT3信号通路[28,29]。IL-6介导的信号通路与乳腺癌[30]、肝癌[31]、胃癌[32]、卵巢癌[33]、结直肠癌[34]等肿瘤的发生、发展密切相关，在放射性肺炎患者、胃癌患者中表达较高[35,36]；是非小细胞肺癌中关键的促肿瘤细胞因子[37]。PRL-3能通过IL-6上调p-AKT和p-STAT3促进结肠癌细胞增殖、迁移[38]。其在癌症中的重要作用或可作为癌症预防和治疗的新靶点[23]。

STAT3是信号转导与转录激活因子中的一种，参与多种因子的信号转导通路，在癌症的发生和发展中非常重要，是关键致癌基因和重要肿瘤靶点之一[39]。STAT3与胃癌的发生发展、转移、治疗和预后密切相关[40]。研究发现STAT3在胃癌细胞[41]、非小细胞肺癌[42]中高表达，说明STAT3与肿瘤的发生有关。研究发现STAT3的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移有关[43]；p-STAT3在胃癌淋巴结转移中的表达明显升高[44]。在胃癌的治疗上，高度激活STAT3会导致肿瘤的发生[45]；阻断STAT3，可抑制AGS细胞[46]、人胰腺癌细胞[47]的生长增殖。异常高表达的磷酸化STAT3会导致膀胱肿瘤恶性进展[48]。Chatterjee等[49]研究发现STAT3的核表达与胃癌患者存活呈负相关。

本研究发现，核桃青皮提取物处理后，胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭显著降低，且迁移侵袭相关基因MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平显著降低，IL-6、p-STAT3蛋白的表达水平显著降低。在核桃青皮提取物处理的基础上添加IL-6后，胃癌细胞的抑制率显著降低，细胞迁移和侵袭数量显著升高。

综上所述，核桃青皮提取物抑制胃癌细胞增殖和迁移，IL-6刺激后逆转了核桃青皮提取物对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，其机制可能与调控IL-6/STAT3的表达有关。可为胃癌的预防和治疗提供新的研究思路和理论依据。