YAP信号通路在姜黄素诱导HepG2肝癌细胞系凋亡中的作用

于洪丹，张舒文，谷学静

(1.锦州医科大学辽宁省糖尿病感知功能障碍重点实验室;2.锦州医科大学附属第一医院消化内科;3.锦州医科大学人体解剖学教研室，辽宁 锦州 121000)

肝癌是导致全球癌症患者死亡的第三大原发性恶性肿瘤，每年死亡人数超过60万人。早期肝癌患者以手术为首要治疗手段，但是对于中晚期肝癌或者术后化疗患者仍以药物治疗为主[1-3]。植物源性中药以其毒性低，副作用小而成为近年来关注的热点。姜黄素是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的重要活性成分之一，在骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种类型肿瘤中表现出抗肿瘤活性[4-5]，但姜黄素在肝癌中的作用及确切机制尚需进一步研究[6]。本研究拟观察姜黄素对HepG2肝癌细胞系增殖、凋亡的影响及机制，期望为肝癌的临床治疗提供新的理论依据和治疗参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人HepG2肝癌细胞系(北纳生物)，姜黄素(纯度≥99%，沈阳药科大学药剂学教研室赠送)，RPMI-1640 (BIOIND)，增强型CCK-8试剂盒(尚宝生物)，ROS检测试剂盒(碧云天)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(索来宝)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(索来宝)，单克隆抗体GAPDH(华美生物)，Cleaved caspase-3、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、Yes相关蛋白(yes-associated protein，YAP)、HRP标记二抗(proteintech)。

1.2 细胞培养与实验分组

HepG2肝癌细胞复苏后置于含10% FBS和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养，隔日换液，0.25%胰酶消化、传代，取对数生长期细胞进行相关实验。称取10 mg姜黄素，溶于0.5 mL DMSO，再利用培养基稀释终浓度为5、10、20 μg/mL姜黄素溶液，DMSO 终浓度最高为1‰。对照组为正常培养基，DMSO组为含1‰的DMSO培养基。

1.3 细胞形态学观察及细胞增殖检测

取对数生长期的HepG2肝癌细胞接种于96孔板内，控制细胞数量为2×103个/孔，贴壁后更换含有姜黄素的培养基100 μL，每个浓度5个复孔。24、48 h后倒置显微镜下观察细胞生长状态，观察拍照，再分别加入CCK-8试剂10 μL，继续 培养1 h，于490 nm测定吸光度(A)。计算细胞活力(cell viability)=(A实验组-A空白)/(A对照组-A空白)×100%。

根据细胞形态观察和细胞增殖检测结果，取10 μg/mL的姜黄素培养基培养48 h检测以下各项指标。

1.4 流式细胞法检测细胞凋亡

取对数生长期的HepG2肝癌细胞接种于6孔板内，控制细胞数量为1×106个/孔，贴壁后分组培养48 h，再胰酶消化收集细胞(1×106/mL)，预冷的PBS清洗两遍，300 g离心10 min，1 mL Bingding Buffer悬浮后弃上清，0.5 mL Binding Buffer重悬细胞，取100 μL细胞于流式管中(2×105个)，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后室温避光孵育10 min，再加入5 μL PI室温避光孵育5 min，加入PBS至500 μL。分别对Annexin V-FITC和PI染料作单阳对照，1 h内用流式细胞仪检测。

1.5 DCFH-DA荧光染色检测细胞ROS水平

取对数生长期的HepG2肝癌细胞接种于6孔板内，控制细胞数量为2×105个/孔，贴壁后分组培养48 h后更换10 μM 的DCFH-DA培养基，继续培养20 min，PBS清洗去掉未装载的探针，激发波长485 nm、发射波长525 nm，细胞成像微孔板检测系统检测细胞ROS水平。

1.6 免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达

取对数生长期的HepG2肝癌细胞接种于6孔板内，控制细胞数量为1×106个/孔，贴壁后分组培养48 h，用RIPA细胞裂解液提取全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，与上样缓冲液混合后100 ℃煮沸5 min，配制10%～12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，湿转法转移到PVDF膜上，5% BSA进行封闭，4 ℃孵育一抗Cleaved caspase-3、Cyt C、YAP过夜，TBST清洗3次后室温孵育二抗2 h，增强化学发光法检测，以GAPDH作为内参。

1.7 统计学方法

使用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，多组样本之间的比较采用单因素方差分析及两两比较的SNK检验，两组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素影响HepG2肝癌细胞系的形态学

显微镜观察细胞形态发现，姜黄素对HepG2肝癌细胞系的形态学影响表现出明显的时间依赖性和剂量依赖性。10 μg/mL姜黄素作用48 h后，贴壁细胞数量明显减少，大量细胞失去原有形态，外形变圆，边缘变亮，与20 μg/mL姜黄素作用24 h或48 h后细胞形态变化类似，见图1。

图1 姜黄素对HepG2肝癌细胞形态的影响

2.2 姜黄素抑制HepG2肝癌细胞系的增殖

CCK-8试剂盒检测结果显示，姜黄素对HepG2肝癌细胞系的增殖有明显的抑制作用。与对照组相比，5 μg/mL姜黄素作用24 h和48 h后细胞抑制作用不明显(P>0.05)，10 μg/mL和20 μg/mL姜黄素作用24 h和48 h均表现出明显抑制效应(P<0.05)。10 μg/mL和20 μg/mL姜黄素组与5 μg/mL姜黄素组相比，同样具有统计学意义(#P<0.05)。本研究选取10 μg/mL姜黄素处理细胞48 h开展后续实验，见图2。

图2 姜黄素对HepG2肝癌细胞增殖抑制率的影响

2.3 姜黄素诱导HepG2肝癌细胞系的凋亡

流式细胞仪检测结果显示，对照组细胞凋亡比例为10.24%，DMSO组细胞凋亡比例为14.50%，两组相比未见显著变化(P>0.05)，而姜黄素组细胞凋亡比例达到26.74 %，明显高于对照组(P<0.05)。结果表明姜黄素能诱导HepG2肝癌细胞系的凋亡，见图3。

其中右上象限代表晚期凋亡，右下象限代表早期凋亡

2.4 姜黄素促进HepG2肝癌细胞系ROS的产生

与对照组相比，姜黄素组细胞绿色荧光明显，DMSO组无明显变化。结果表明姜黄素组细胞ROS水平明显升高，姜黄素能促进肝癌HepG2细胞发生氧化应激，见图4。

图4 姜黄素对HepG2肝癌细胞内活性氧(ROS)水平的影响

2.5 姜黄素对YAP信号通路蛋白表达的影响

与对照组相比，凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cyt C表达明显升高，YAP的蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，DMSO组无显著变化(P>0.05)，见图5。

图5 姜黄素对HepG2肝癌细胞相关蛋白表达水平的影响

3 讨 论

姜黄素是姜科植物姜黄根茎中存在的一种亮黄色疏水多酚类化合物，对多发性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种类型肿瘤均表现出明显的抗肿瘤活性[5，7]1-13。姜黄素可通过多种机制发挥抗肿瘤作用，如调节MAPK信号通路、Notch-1信号通路以及调节NF-κB、COX-2、ROS含量等[8-10]。姜黄素双向调节氧化应激反应，在慢性肾病、痛风性关节炎等疾病中，具有降低线粒体中活性氧类物质、清除自由基的功能[11]；而在肿瘤细胞中，姜黄素及其类似物具有促进氧化应激，诱导肿瘤细胞凋亡的功能[12]。本研究中也发现姜黄素能显著增加HepG2肝癌细胞系中ROS水平，促进氧化应激的发生。

YAP是一种重要转录调节因子，对肿瘤细胞的增殖和凋亡起到重要调控作用。研究发现姜黄素可抑制胰腺癌细胞中YAP-Notch信号通路进而抑制癌细胞的增殖[13]，同样在膀胱癌和结肠癌中也发现姜黄素可降低YAP信号通路起到抗肿瘤的作用[14]。本研究也发现姜黄素能明显下调HepG2肝癌细胞系中YAP蛋白的表达。YAP可调控的蛋白包括细胞周期相关蛋白、p53凋亡信号相关蛋白、Wnt/β-catenin信号相关蛋白等[15-16]。此外，YAP还可以调控ROS的含量，如YAP能正调控抗氧化基因过氧化氢酶的转录，进而下调ROS水平[17]。与之类似，本研究发现姜黄素抑制HepG2肝癌细胞YAP蛋白的表达，导致ROS在细胞内堆积，发生了明显的氧化应激。

适量的ROS能促进肿瘤细胞增殖，但大量的ROS产生会诱导肿瘤细胞凋亡[18]。高水平的ROS能促进细胞发生氧化应激反应、导致DNA氧化性损伤，激活p53依赖性凋亡信号通路[19]。细胞内ROS的累积还会导致线粒体氧化性损伤，线粒体膜通透性发生改变，引起bcl-2家族促凋亡蛋白Bax上调，抑凋亡蛋白Bcl-2下调，促使线粒体释放细胞色素C (cytochrome C，Cyt C)到胞质中，导致caspase家族的凋亡执行蛋白Caspase 3激活，最终引发细胞的凋亡过程[20]。本研究中，伴随着ROS的堆积，HepG2肝癌细胞系发生了明显的凋亡。因此，姜黄素可能通过诱发氧化应激的机制诱导了HepG2肝癌细胞系凋亡。

综上所述，本研究中姜黄素在HepG2肝癌细胞系中表现出明显的抗肿瘤活性，可抑制HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡。其机制可能与姜黄素抑制YAP表达，促进ROS在细胞内堆积，诱发氧化应激反应，进而引发凋亡反应相关。