Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的交互作用及机制研究*

周 晗， 杨文欣， 王华东， 胡巢凤△

（1暨南大学基础医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理学实验室，广东广州510632；2佛山市禅城区中心医院，广东佛山528031）

自噬是一种存在于真核细胞中的保守、常见的代谢过程。在营养缺乏、损伤、高温、低氧和氧化应激等外界刺激以及病原体感染等情况下可诱导自噬［1］。细胞中单层或双层膜包绕待降解物，从而形成分隔膜，当分隔膜延伸并完全包绕待降解物（如细胞器和蛋白质）则形成自噬体［2-5］。越来越多的研究表明，自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用，并且与凋亡存在密切的联系；但是，自噬在肿瘤中所起的作用及其与凋亡的确切关系仍存在较多的争议。

受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，Rip2）属于Rip 家族成员，广泛表达于人体组织（如心脏、脑组织、胎盘、肺、脾脏、胰腺、淋巴结等），定位于胞浆［6］。NOD 样受体家族是胞质蛋白，其主要成员NOD1 可识别革兰阴性杆菌肽聚糖，通过与Rip2 结合诱导自噬和炎症反应的发生，Rip2 对于NOD1 诱导白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）的产生和自噬体的形成是必不可少的，但未对其作用机制进行研究［7］。研究发现，在肠上皮细胞中，NOD2可通过Rip2 的酪氨酸激酶活性激活p38 MAPK 信号通路，同时抑制蛋白磷酸酶发生磷酸化，诱导自噬的发生［8］。然而，一项关于克罗恩病的研究表明，NOD1 和NOD2 在细菌入侵细胞的位点募集自噬相关蛋白ATG16L1至细胞膜，诱发自噬，抑制炎症因子的释放，该过程却没有NF-κB和Rip2的参与［9］。

本课题组前期研究证实，Rip2可通过激活内、外源性凋亡途径诱导人胰腺癌Panc-1 细胞凋亡［10］；Rip2 还能引起Panc-1 细胞自噬，其机制可能与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的活化有关［11］。Rip2诱导的自噬和凋亡是否具有交互作用，有待进一步研究。因此，本研究主要探讨Rip2 导致的Panc-1 细胞自噬和凋亡是否具有交互作用及其作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

Panc-1 细胞由中山大学中山医学院赠予。pEGFP-Rip2 质粒由本实验室前期构建；jetPRIME 转染试剂购自 Polyplus；抗 Rip2 抗体购自 Santa Cruz；抗LC3、beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、Fas、细胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）和GAPDH抗体均购自Cell Signaling Technology；caspase-3、-8、-9活性检测试剂盒购自BioVision；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购自大连美仑生物技术有限公司；凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 购自Med-Chem Express。

2 方法

2.1 自噬抑制剂3-MA 对Rip2 诱导Panc-1 细胞凋亡的影响

2.1.1 质粒转染 用jetPRIME 分别转染pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2 重组质粒至Panc-1 细胞，6 h后更换新鲜的DMEM培养基，继续培养42 h。

2.1.2 实验分组 （1）对照组:仅培养细胞，不做任何处理；（2）pEGFP-C2 组:转染pEGFP-C2 质粒入细胞；（3）3-MA组:细胞培养6 h，加入含自噬抑制剂3-MA的DMEM 培养基培养细胞42 h；（4）pEGFP-Rip2组:转染pEGFP-Rip2 重组质粒至细胞；（5）pEGFPRip2+3-MA 组:转染pEGFP-Rip2 重组质粒至细胞6h，更换新鲜DMEM 培养基，同时加入3-MA，继续培养42 h。实验中所用的3-MA 剂量要求对细胞活力没有显著影响，且能抑制Rip2诱导的细胞自噬。

2.1.3 MTT 法检测细胞活力 将细胞以每孔0.5×104的密度接种于96 孔板内，培养6 h，再分别加入不同浓度（0.25、0.5、1、2、4 和8 mmol/L）自噬抑制剂3-MA处理42 h，每组6个复孔。吸弃孔内培养液，每孔加入 180μL 不含血清的 DMEM 培养基和 MTT 溶液20 μL，震荡混匀后在细胞培养箱内孵育4 h。去上清后，每孔加入DMSO 150 μL，37℃低速震荡5 min，多功能酶标仪于490 nm 检测各孔吸光度（absorbance，A），计算细胞活力。

2.1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将细胞以每孔3×105的密度接种于6 孔板内，对细胞进行相应处理后，收集细胞，加 1× binding buffer 及 Annexin VPE，混匀后避光孵育15 min，然后再加入7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD），混匀后立即上机检测。

2.1.5 Western blot 检测蛋白表达 用胰酶消化并收集细胞。加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制剂，提取细胞胞浆蛋白并检测蛋白的浓度。分离蛋白，将蛋白转移至硝酸纤维薄膜上，放置于封闭液中封闭1 h。加入Ⅰ抗，4℃孵育12～16 h，再加入Ⅱ抗，用GAPDH作为内参照［10］。

2.1.6 caspase-8、-9、-3活性的检测 首先收集细胞置于离心管内，每管细胞数量最好为（2～5）×106。用相应的试剂盒，按照所需的剂量将2×Reaction Buffer和 DTT 以 100∶1 的体积比混合均匀；每管加入 50 μL冰上预冷的Cell Lysis Buffer 重悬细胞沉淀，冰上孵育10 min；10 000×g离心1 min；吸取上清液转移至另一离心管内，每管吸取5 μL 细胞裂解液进行BCA蛋白定量；取 100～200 μg 蛋白和 50 μL Cell Lysis Buffer，混合后加入96孔板内；再加入50 μL 2× Reaction Buffer（含DTT），并分别加入 5 μL IETD-pNA、LEHD-pNA 和 DEVD-pNA（分别为 caspase-8、-9、-3的底物）。震荡混匀后，置于细胞培养箱避光孵育2 h；用多功能酶标仪在405 nm 处测定各孔A值。将各组A值的平均值与对照组A值的平均值相比，根据蛋白浓度计算各组细胞样品caspase-8、-9、-3的活性。

2.2 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK对Rip2诱导Panc-1细胞自噬的影响

2.2.1 实验分组 （1）对照组:仅培养细胞，不做任何处理；（2）pEGFP-C2 组:转染pEGFP-C2 质粒入细胞；（3）Z-VAD-FMK 组:细胞培养 6 h，加入含 caspases 抑制剂 Z-VAD-FMK 的 DMEM 完全培养基培养细胞 42 h；（4）pEGFP-Rip2 组:转染 pEGFP-Rip2 重组质粒至细胞；（5）pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组:将pEGFP-Rip2 质粒转染至细胞，6 h 后更换培养基，再加入Z-VAD-FMK 继续培养42 h。实验中所用的ZVAD-FMK 剂量要求对细胞活力没有显著影响，且能抑制Rip2诱导的细胞凋亡。

2.2.2 蛋白表达检测 参见2.1.5。

2.2.3 透射电镜观察细胞内自噬体的数量及形态 将细胞以每孔3×105的密度接种于6 孔板，具体方法见参考文献［11］。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件对实验数据进行分析，数据用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较则采用Bonferroni法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 3-MA促进Rip2诱导的细胞凋亡

1.1 转染pEGFP-Rip2质粒后细胞Rip2蛋白表达的变化 Western blot 结果显示，与对照组和pEGFP-C2组比较，pEGFP-Rip2 组细胞Rip2 蛋白表达显著增加（P＜0.01），见图1。以上结果说明pEGFP-Rip2 质粒被成功转入细胞。

Figure 1.The protein level of Rip2 in Panc-1 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group.图1 Panc-1细胞Rip2蛋白水平

1.2 MTT 法检测不同剂量3-MA 对Panc-1细胞活力的影响 用不同浓度（0.25、0.5、1、2、4 和8 mmol/L）的自噬抑制剂3-MA 处理Panc-1细胞，MTT 法检测结果显示，与对照组相比，0.25、0.5、1 和 2 mmol/L 3-MA对细胞活力没有显著影响，而4和8 mmol/L 3-MA可显著降低细胞活力（P＜0.05，P＜0.01），见图2。我们在预实验中发现，2 mmol/L 3-MA 可抑制过表达Rip2 导致的细胞自噬，因此确定后续实验中所用3-MA 剂量为2 mmol/L，该剂量既不影响细胞活力，又可以抑制Rip2诱导的细胞自噬。

1.3 3 -MA 促进Rip2诱导的细胞凋亡 流式细胞术结果分析的散点图中，Q2 区表示早期凋亡细胞，Q4区表示晚期凋亡细胞。流式细胞术结果显示，与对照组和pEGFP-C2 组相比，pEGFP-Rip2 组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；而与 pEGFP-Rip2 组比较，pEGFP-Rip2+3-MA 组细胞凋亡率进一步升高（P＜0.05），见图3。

1.4 3 -MA 对过表达Rip2细胞凋亡相关蛋白表达的影响 pEGFP-Rip2 组细胞 Fas、Bax 及胞浆 Cyt-c 蛋白水平显著高于对照组和pEGFP-C2组（P＜0.05），而pEGFP-Rip2+3-MA 组细胞 Fas、Bax 蛋白及胞浆 Cyt-c蛋白水平进一步升高（P＜0.05）；此外，pEGFP-Rip2组细胞Bcl-2 蛋白水平显著低于对照组和pEGFP-C2组（P＜0.05），而 pEGFP-Rip2+3-MA 组细胞 Bcl-2 蛋白水平进一步下降（P＜0.05），见图4。

Figure 2.The effect of different doses of 3-MA on the viability of Panc-1 cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 不同剂量3-MA对Panc-1细胞活力的影响

Figure 3.The effect of 3-MA on the apoptosis of Panc-1 cells induced by Rip2.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.图3 3-MA对Rip2诱导的Panc-1细胞凋亡的影响

1.5 3 -MA 增强过表达 Rip2 细胞 caspase-8、-9、-3 的活性 pEGFP-Rip2 组细胞 caspase-8、-9、-3 的活性显著高于对照组和pEGFP-C2 组（P＜0.05）；与pEGFPRip2 组比较，pEGFP-Rip2+3-MA 组细胞 caspase-8、-9、-3的活性进一步升高（P＜0.05），见图5。

Figure 4.The effect of 3-MA on the protein levels of Fas，Bax，Bcl-2 and cytoplasmic Cyt-c in the Panc-1 cells with Rip2 overexpression.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.图4 3-MA对过表达Rip2的Panc-1细胞Fas、Bax、Bcl-2及胞浆Cyt-c蛋白水平的影响

Figure 5.The effect of 3-MA on caspase-8，-9 and -3 activity in the Panc-1 cells with Rip2 overexpression.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group and pEGFP-C2 group；#P＜0.05 vs pEGFP-Rip2 group.图5 3-MA对过表达Rip2的Panc-1细胞caspase-8、-9、-3活性的影响

2 Z-VAD-FMK促进Rip2诱导的细胞自噬

2.1 MTT 法检测不同剂量 Z-VAD-FMK 对 Panc-1 细胞活力的影响 用不同浓度（5、10、20 和40 μmol/L）的 caspases 抑制剂 Z-VAD-FMK 处理 Panc-1 细胞，MTT 法检测细胞活力结果显示，与对照组比较，5、10 和 20 μmol/L Z-VAD-FMK 对细胞活力没有显著的影响，而40 μmol/L Z-VAD-FMK 可显著降低细胞活力（P＜0.05），见图6。我们在预实验中发现，10 μmol/L Z-VAD-FMK 可抑制过表达Rip2 导致的细胞凋亡，因此选择10 μmol/L 为后续实验中Z-VADFMK的剂量。

2.2 Z-VAD-FMK 对过表达Rip2 细胞自噬相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，pEGFP-Rip2组细胞beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表达显著多于对照组和pEGFP-C2组（P＜0.01）；与pEGFP-Rip2组比较，pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组细胞 beclin-1 和 LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步升高（P＜0.01），见图7。

Figure 6.The effect of different doses of Z-VAD-FMK on the viability of Panc-1 cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.图6 不同剂量Z-VAD-FMK对Panc-1细胞活力的影响

2.3 Z-VAD-FMK 对过表达Rip2 细胞内自噬体数量的影响 pEGFP-Rip2 组细胞内自噬体的数量显著多于对照组和pEGFP-C2 组；pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组细胞内自噬体数量则显著多于pEGFP-Rip2组，见图8。

Figure 7.The effect of Z-VAD-FMK on the protein expression levels of beclin-1 and LC3-Ⅱin the Panc-1 cells of different groups.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；##P＜0.01 vs pEGFP-Rip2 group.图7 Z-VAD-FMK对各组Panc-1细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平的影响

Figure 8.Changes of the autophagosomes in Panc-1 cells observed under transmission electron microscope（scale bar=2 μm）.A:control group；B:pEGFP-C2 group；C:Z-VAD-FMK group；D:pEGFP-Rip2 group；E:pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK group.M:mitochondrion；N:nucleus.Arrows indicate autophagosomes.图8 透射电镜下观察细胞自噬体的变化

2.4 Z-VAD-FMK抑制过表达Rip2细胞Akt 和mTOR 蛋白磷酸化 Western blot 结果显示，与对照组和pEGFP-C2组相比，pEGFP-Rip2组细胞p-Akt和p-mTOR 蛋白水平显著降低（P＜0.01），而总 Akt 和mTOR 蛋白表达变化不显著；与pEGFP-Rip2 组比较 ，pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组 细 胞 p-Akt 和 pmTOR 蛋白水平进一步下降（P＜0.01，P＜0.05），总Akt 和mTOR 蛋白表达则无显著变化，见图9。上述结果说明Z-VAD-FMK 可抑制过表达Rip2 细胞Akt和mTOR蛋白磷酸化。

讨 论

目前普遍认为，细胞自噬的保护性和抑制性作用与多种因素相关，并且具有组织特异性。保护性自噬可帮助肿瘤细胞逃避各种刺激因素所诱导的凋亡，而抑制性自噬可促进肿瘤细胞凋亡。因此，我们应用3-MA抑制细胞自噬，观察过表达Rip2诱导的细胞凋亡的变化情况；应用caspases 抑制剂Z-VADFMK 抑制细胞凋亡，观察过表达Rip2 诱导的细胞自噬的变化情况，从而探究自噬与凋亡的相互作用及其机制。

外源性途径和内源性途径是介导细胞凋亡信号的2 条主要通路。在外源性凋亡途径中，胞外的死亡配体结合于细胞表面的死亡受体，并使其活化，从而诱导凋亡的发生。例如，三聚体FasL与其受体Fas结合后，使Fas的死亡结构域活化，募集接头蛋白Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain protein，FADD），FADD 可引起 procaspase-8 自我剪切活化，进而启动凋亡。内源性凋亡通路是由线粒体损伤导致Cyt-c 释放及caspases 活化的信号通路。当线粒体受损时，线粒体膜通透性转换孔开放，水分进入，大量Cyt-c 释放进入胞浆，Cyt-c 作用于凋亡酶激活因子，使caspase-9 活化，从而激活caspase-3，导致凋亡［12-13］。Bcl-2 家族可调节线粒体外膜的完整性和通透性，参与调节线粒体凋亡通路，按其功能特点，可分为抗凋亡蛋白亚家族（Bcl-2、Bcl-xL 等）和促凋亡蛋白亚家族（Bax、Bak等）［14］。

Figure 9.The ratios of p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR in the Panc-1 cells of different groups.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group or pEGFP-C2 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs pEGFP-Rip2 group.图9 各组Panc-1细胞p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值

本研究发现，pEGFP-Rip2 组细胞凋亡率显著高于对照组和 pEGFP-C2 组，而 pEGFP-Rip2+3-MA 细胞凋亡率进一步升高，说明抑制细胞自噬可促进Rip2 诱导的细胞凋亡。为了探究其作用机制，我们检测了凋亡相关蛋白的表达水平，结果显示，pEGFPRip2组细胞Fas、Bax 和胞浆Cyt-c蛋白水平显著高于对照组和pEGFP-C2 组，Bcl-2 蛋白表达则显著减少，而pEGFP-Rip2+3-MA组细胞Fas、Bax和胞浆Cyt-c蛋白水平进一步升高，Bcl-2 蛋白表达水平进一步下降。同时，检测各组细胞caspase-8、9、-3 的活性，结果显示，pEGFP-Rip2 组细胞caspase-8、-9、-3 的活性显著高于对照组和pEGFP-C2 组，而pEGFP-Rip2+3-MA 组细胞 caspase-8、-9、-3 的活性进一步升高。以上结果证实，抑制细胞自噬可促进Rip2 诱导的细胞凋亡，其机制可能与进一步激活内、外源性凋亡途径有关。

众所周知，自噬发生时beclin-1 蛋白表达通常会增多，这种蛋白是诱发细胞自噬的关键蛋白之一［15］。此外，LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，LC3-Ⅰ分布于胞浆中，Atg7 激活LC3-Ⅰ，使LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合而成为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜上，LC3-Ⅱ的表达水平可以在一定程度上反映自噬体的数量［16］。目前透射电镜被认为是检测自噬的金标准。本研究结果显示，pEGFP-Rip2组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平显著高于对照组和pEGFP-C2 组；而pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组细胞 beclin-1 和 LC3-Ⅱ蛋白水平进一步升高。同时，在透射电镜下观察到，pEGFP-Rip2 组细胞内自噬体的数量显著增多；而pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK 组细胞内自噬体数量较pEGFP-Rip2 组进一步增多。以上结果说明，用ZVAD-FMK 抑制细胞凋亡可促进Rip2 诱导的细胞自噬。

PI3K/Akt/mTOR 通路是目前唯一已知的自噬抑制信号通路。PI3K是一种广泛存在于多种细胞中的脂质激酶。在受到来自酪氨酸激酶等信号刺激后，PI3K 将磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）转化为磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3），PI3K 可以与 Akt 的 N 端 PH 结构域结合，在 3-磷酸肌醇依赖性激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1）的辅助下使Akt 活化。mTOR 是活化后的Akt 底物，活化的 Akt 可以使 mTOR 磷酸化，激活mTOR，从而抑制自噬［17-18］。本研究结果显示，pEGFPRip2 组细胞p-Akt 和p-mTOR 蛋白水平显著低于对照组和pEGFP-C2 组，而总Akt 和mTOR 蛋白表达变化却不显著；pEGFP-Rip2+Z-VAD-FMK组细胞p-Akt和p-mTOR 蛋白水平则进一步下降，但总mTOR 和Akt 蛋白表达未见显著变化。以上结果说明，Z-VAD-FMK抑制凋亡可促进Rip2诱导的自噬，其作用机制可能与进一步抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的活性有关。

综上所述，在人胰腺癌细胞中，抑制自噬可增强Rip2诱导的细胞凋亡，同时进一步激活内、外源性凋亡途径；而抑制凋亡可促进Rip2诱导的细胞自噬，并进一步下调PI3K/Akt/mTOR 通路的活性。因此，本研究证实了Rip2诱导的细胞自噬和凋亡具有交互拮抗作用。这些结果为寻找治疗胰腺癌的新靶点提供了实验依据。