氯喹通过抑制NF-κB和MAPK信号通路减轻脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应*

方明楚， 林振浪

（温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院新生儿科，浙江温州325027）

炎症反应在中枢神经系统疾病的发生和发展中扮演着重要的角色。介导中枢神经系统疾病的炎症反应是以小胶质细胞过度活化为特征的病理过程。小胶质细胞是中枢神经系统内主要的免疫细胞，静息状态时表现出免疫监视的功能，维持神经系统内环境稳定；当受到炎症、感染、缺血缺氧等病理刺激时被激活，由静息状态转变为活化状态，表现出促炎功能［1］。众多研究发现，小胶质细胞受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激后会被激活并大量分泌白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP1）、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）等促炎因子［2］，而大量释放的炎症介质参与中枢神经系统的炎症反应并加剧神经细胞的损伤。因此，在神经系统炎症性疾病治疗中，如何抑制小胶质细胞的过度活化从而减轻过度炎症反应对神经系统造成的损害至关重要。

氯喹（chloroquine，CQ）是一种应用于临床的抗疟疾药物，具有一定的安全性，具有抑制自噬、调节免疫、抗炎等多种性能［3］。在体外实验研究中，氯喹能显著抑制脂多糖/内毒素诱导的巨噬细胞炎症反应，表现出良好的抗炎特性［4］。此外，在肺损伤、肝损伤、哮喘和胰腺炎等动物模型实验研究中，氯喹能显著减轻炎症反应起到良好治疗效果［5-6］。而当前有关氯喹在中枢神经系统中的抗炎特性研究较少，且氯喹是否能够通过抑制小胶质细胞活化并减少炎症反应及其相关机制尚不明确。本研究观察了氯喹对脂多糖诱导的BV2 细胞炎症因子释放的抑制作用，并初步探讨了其相关机制，旨在为中枢神经系统炎症性疾病提供新的实验资料。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1 主要试剂 BV2 细胞购自中国协和医科大学细胞中心。DMEM 培养基、链/青霉素、无菌PBS溶液和 0.25% 胰蛋白酶溶液（Gibco）；胎牛血清（Hy-Clone）；LPS和氯喹（Sigma）；TRIzol试剂（Roche）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；SYBR Green（Bio-Rad）；引物和 RNase-free H2O（Sangon Biotech）；小鼠 TNF-α 和IL-6 ELISA 试剂盒（eBioscience）；抗 NF-κB p65 和IκB-α 抗体（Santa Cruz）；抗JNK、p-JNK、p38 和p-p38抗体（Cell Signaling Technology）；IgG-488Ⅱ抗（Abcam）；IgG-HRP Ⅱ抗（Bioworld）。

1.2 主要仪器 倒置显微镜和正置荧光显微镜（Nikon）；CFX96 TouchTM荧光定量 PCR 仪及 SDSPAGE电泳仪、电转仪和凝胶成像系统（Bio-Rad）。

2 实验方法

2.1 细胞培养与分组 将小鼠BV2 小胶质细胞置于饱和湿度的恒温培养箱（5% CO2、37℃）中，用DMEM 培养基（含10 mg/L 链霉素、1×105U/L 青霉素、10 mmol/L 谷氨酰胺及10%胎牛血清）培养BV2 细胞。1～2 d更换1次培养基，5 d左右传代，选取优良生长状态的细胞进行实验。氯喹和LPS 粉末均用无菌PBS 溶液溶解。实验分为对照（control）组、LPS 组和LPS+CQ组。根据实验要求，将BV2细胞均匀铺于6 孔板中，LPS+CQ 组的 BV2 细胞预先给予 10 μmol/L的氯喹处理30 min 后再给予LPS 刺激，在LPS 组和LPS+CQ 组中加入 500 μg/L 的 LPS 分别作用 30 min、6 h和24 h。

2.2 倒置显微镜观察细胞形态学的改变 LPS刺激24 h 后，将BV2 细胞置于倒置显微镜下观察。每组样品取3个不同视野计数，重复3次。活化BV2细胞的相对数=（多极型细胞数量+纺锤样双极细胞数量）/总细胞数量。

2.3 RT-qPCR 检 测 BV2 细 胞 内 TNF-α 和 IL-6 的mRNA 表达情况 LPS刺激6 h后，收集BV2细胞，按TRIzol 试剂盒说明书抽提细胞总RNA，测定总RNA浓度并鉴定纯度，然后根据RNA 逆转录试剂盒说明书步骤将总RNA 逆转录成cDNA。逆转录后得到的cDNA 通过荧光定量PCR 的方法，检测荧光信号强度，然后转化成Ct 值。以β-actin 作为内参照来消除因标本处理、PCR 反应和逆转录不同而出现的差异。因此，用目的指标mRNA 与内参照β-actin mRNA 含量的比值作为该指标的mRNA 表达水平指标。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 ELISA 检测 BV2 细胞上清液中 TNF-α 和 IL-6蛋白的含量 LPS刺激24 h后，收集细胞培养上清液1 mL 于EP 管中，离心后取上清按照ELISA 检测试剂盒的说明书进行操作，测定上清液中TNF-α 和IL-6的蛋白水平。

2.5 Western blot 检测 BV2 细胞内 IκB-α 蛋白表达情况及JNK 和p38 蛋白的磷酸化水平 LPS 刺激30 min 后，弃去培养基，预冷的PBS 清洗3 次，每孔加入80 μL 细胞裂解液并于冰上裂解20 min。刮刀均匀刮取孔内的细胞，吸取至EP 管内，4℃、12 000 r/min离心10 min。BCA 法测定上清液蛋白浓度，配制20 μL体系（40 μg总蛋白/泳道），100 ℃变性10 min。总蛋白经10% SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，5% BSA 室温封闭 90 min，TBST 洗膜后加入抗 IκB-α抗体（1∶300 稀释）、抗p-JNK 抗体（1∶1 000 稀释）、抗p-p38 抗体（1∶1 000 稀释）和抗β-actin 抗体（1∶3 000稀释），放置在4℃摇床中过夜，次日取出后置室温放置1 h，TBST 洗膜后加入Ⅱ抗（1∶10 000 稀释），室温摇床中孵育2 h，TBST洗膜，曝光、显色。膜再生后加入抗 JNK 抗体（1∶1 000 稀释）、p38 抗体（1∶1 000 稀释）4℃摇床中过夜，次日取出后于室温放置1 h，TBST洗膜后加入Ⅱ抗（1∶10 000稀释），室温摇床孵育2 h，TBST 洗膜，曝光、显色。以IκB-α/β-actin、p-JNK/JNK和p-p38/p38灰度比值进行定量分析。

2.6 免疫荧光染色法检测BV2 细胞内NF-κB 蛋白的核内移位情况 取对数生长期细胞，接种于内置细胞拍片的6 孔板中（每孔1×106个）。进行分组处理，LPS 刺激 30 min 后，弃去培养基，PBS 清洗 2 次。细胞爬片用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次。0.1% Triton X-100 孵 育 10 min 后 ，PBS 清 洗 。 5%BSA 室温封闭30 min，弃去多余的封闭液，不洗。滴加抗NF-κB p65抗体（1∶300稀释），4℃孵育过夜。次日取出，PBS清洗。滴加荧光Ⅱ抗（1∶1 000稀释），避光室温孵育1 h。PBS 避光清洗后，滴加DAPI 染核7 min。PBS 避光清洗，滴加抗荧光淬灭剂封片后于正置荧光显微镜下观察拍片。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 5 软件中单因素方差分析的Tukey 法来分析数据。计量数据用均数±标准差（mean±SD）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 氯喹对LPS刺激下BV2细胞形态学的影响

LPS 刺激24 h 后，倒置显微镜下观察各组BV2细胞的形态。结果显示，对照组绝大部分BV2 细胞形态呈圆形或者椭圆形，提示细胞处于静息状态；LPS组大多数细胞的形态呈分枝样改变，体积较静息状态下增大，且部分细胞向多极细胞转变或向两级延长、呈纺锤样改变，提示LPS 组存在较多呈现活化形态的BV2 细胞；而在LPS+CQ 组中，呈现活化形态的BV2 细胞数量较LPS 组显著减少。通过统计呈现活化形态的BV2 细胞占总细胞数量的比值，我们发现LPS 组中呈现活化形态的BV2 细胞数占总BV2 细胞数量的比值显著高于对照组（P＜0.01），而预先给予氯喹能够明显降低活化细胞数比值（P＜0.05），见图1。

2 氯喹对 LPS 刺激下 BV2 细胞释放 TNF-α 和 IL-6的影响

LPS 刺激 6 h 后，我们通过 RT-qPCR 来检测 BV2细胞内TNF-α和IL-6的转录水平。结果显示，LPS组BV2 细胞内 TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 水平相比于对照组均显著上升（P＜0.01），而LPS+CQ 组BV2 细胞内TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 表达水平较 LPS 组均明显降低（P＜0.01），见图2A。LPS 刺激24 h 后，我们采用ELISA 法来检测上清液中炎症因子的含量，结果显示，细胞培养上清液中的TNF-α 和IL-6 的表达水平较对照组均显著上升（P＜0.01）；而预先给予氯喹在蛋白水平上明显抑制了 TNF-α 和IL-6 的表达（P＜0.05），见图2B。由此可见，CQ 能抑制 LPS 诱导BV2细胞的炎症反应。

3 氯喹对LPS 刺激下BV2 细胞中MAPK 信号通路的影响

LPS 刺激 30 min 后，我们通过 Western blot 测定MAPK 家族中与炎症密切相关的p38 和JNK 蛋白磷酸化的程度。结果显示，相比于对照组，LPS 刺激后显著提高了BV2 细胞内p38 和JNK 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；与LPS 组相比，预先给予氯喹明显抑制了BV2 细胞内p38 和JNK 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05），见图3。由此可见，CQ 是通过抑制 MAPK 信号通路来减轻LPS刺激的BV2细胞炎症反应的。

Figure 1.The effect of CQ on the morphological changes of LPS-induced BV2 microglia.Scale bar=200 μm.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图1 氯喹对LPS刺激下BV2细胞形态改变的影响

Figure 2.Effects of CQ on LPS-induced TNF-α and IL-6 production in the BV2 microglia.A:relative mRNA levels of TNF-α and IL-6 were detected by RT-qPCR；B:the secretion of TNF-α and IL-6 was detected by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图2 氯喹对LPS刺激下BV2细胞释放TNF-α和IL-6的影响

4 氯喹对LPS 刺激下BV2 细胞中NF-κB 信号通路的影响

LPS 刺激 30 min 后，我们采用 Western blot 方法检测IκB-α蛋白降解的情况，并通过免疫荧光来观察NF-κB p65 蛋白的核内转移情况。Western blot 结果显示，相比于对照组，LPS 组细胞内 IκB-α 蛋白水平明显降低（P＜0.01），提示LPS刺激后IκB-α蛋白大量降解；而预先给予氯喹后IκB-α 蛋白表达较LPS组显著增加（P＜0.05），提示氯喹可以减少 LPS 所致的IκB-α 蛋白降解，见图4A。免疫荧光结果显示，对照组中NF-κB p65的绿色荧光主要聚集在细胞质内，且强度较弱；而 LPS 刺激后，NF-κB p65 的绿色荧光大量聚集在细胞核内，且荧光强度增强，提示LPS 刺激会使BV2 细胞中NF-κB p65 蛋白表达增多，且由细胞质向细胞核内转移；相比于LPS 组，LPS+CQ 组BV2 细胞核内的绿色荧光减少且强度有所下降，反而胞质内的绿色荧光表达有所增多。由此可见，CQ还可通过抑制NF-κB 信号通路来减轻LPS 刺激下BV2细胞的炎症反应。

Figure 3.Effects of CQ on LPS-induced phosphorylation of JNK and p38 in the BV2 microglia.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图3 氯喹对LPS刺激下BV2细胞内p38和JNK的蛋白磷酸化水平

Figure 4.Effects of CQ on the expression of IκB-α（A）and nuclear location of NF-κB（B）in LPS-stimulated BV2 microglia.Scale bar=200 μm.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图4 氯喹对LPS刺激下BV2细胞中NF-κB炎症信号通路的影响

讨 论

许多中枢神经系统疾病的病理过程中均有炎症反应的参与［7］。小胶质细胞的激活是神经炎症反应的特征之一，在中枢神经系统疾病进展中占据着重要的位置。当中枢神经系统受到外伤、感染、缺氧缺血等，小胶质细胞因受病理因素刺激由静止态向活化态转变，引发过度的炎症反应，诱发神经系统疾病，如脑外伤、脑缺血再灌注损伤、新生儿脑损伤等疾病［2］。LPS是经典的炎症模型诱导物。LPS刺激小胶质细胞被广泛用于模拟中枢神经系统内革兰氏阴性细菌感染引起的小胶质细胞活化。BV2 细胞是小鼠胶质瘤细胞，具备原代培养的小胶质细胞的表型及各项功能。因此，本研究通过LPS 刺激BV2 细胞建立经典的神经炎症细胞模型。结合我们课题组前期研究基础，本研究选择500 μg/L 的LPS 来刺激BV细胞建立神经炎症细胞模型［8］。

氯喹是广泛应用于临床中的一种抗疟疾药物，它具有较好的免疫调节和抑制自噬、抗炎等药理学作用。当前，许多基础研究表明氯喹在缺血性脑损伤、脑创伤和脊髓损伤等神经系统疾病中通过调节自噬起到良好的神经保护作用，其有关抗炎特性的研究较少［9-11］。在神经炎症细胞模型中，Koch 等［12］的研究表明氯喹能显著减少LPS 刺激的人类小胶质细胞中促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-12）的分泌，但氯喹的抗炎作用是通过何种信号通路来实现的尚未被阐述。Koch 等［12］研究显示在 LPS 刺激的人类小胶质细胞中预先给予10 μmol/L 氯喹就能显著地减少LPS刺激下的小胶质细胞分泌TNF-α，且此浓度下人脑小胶质细胞仍具有较高存活率［12］。故本研究中选择10 μmol/L的浓度作为氯喹的最适药物浓度。

在本研究中，我们发现500 μg/L的LPS刺激24 h后，BV2 细胞的形态发生显著地改变，BV2 细胞在LPS 刺激后由静息态向活化态转变，而CQ 组则逆转了这一改变，提示氯喹具有抑制LPS 刺激下BV2 细胞向活化方向转变的作用。

活化的小胶质细胞会分泌过多的炎症因子，尤其是促炎因子。TNF-α 和IL-6 是促炎性细胞因子，在中枢神经系统炎症反应中起着重要作用，它们除了能直接损伤神经元外，还能刺激星形胶质细胞分泌炎症因子和NO 等炎症介质加剧神经元和少突胶质细胞损伤［13］。因此，本研究对 TNF-α 和 IL-6 这两种炎症因子的表达水平进行了检测，结果显示BV2细胞在 LPS 刺激后 TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 及蛋白水平均增加，证实我们所建立的炎症反应细胞模型是成功的。而预先给予氯喹能显著下调LPS 活化的BV2 细胞内 TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 和蛋白的表达。由此可见，氯喹能在转录和翻译水平显著抑制LPS活化的BV2 细胞过度表达促炎因子，进一步证实了氯喹能减轻LPS诱导的BV2细胞炎症反应。

在LPS 诱导的神经炎症反应发生发展过程中，LPS激活MAPK 和NF-κB信号通路，从而促进多种促炎因子基因表达和炎症因子产生、释放［14］。MAPK是小胶质细胞氧化还原信号转导中的重要激酶，调控促炎因子、趋化因子、酶类的基因表达。MAPK 家族成员包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK 和p38，三者主要以非磷酸化形式存在于细胞质中。其中p38，JNK 作为应激活化蛋白激酶在炎症反应中起关键作用。过度活化的小胶质细胞能够通过提高MAPK 家族中3 个亚型的磷酸化水平来调控神经炎症因子的产生。因此，我们也检测了氯喹对LPS诱导的BV2细胞中JNK和p38 磷酸化水平的影响。本研究发现，预先给予氯喹能显著抑制BV2 细胞内JNK 和p38 的磷酸化。NF-κB 是是关键的炎症反应调节因子，在静息细胞中，NF-κB 和其抑制剂 IκB-α 紧密结合形成 NF-κBIκB 复合物并定位于细胞质内；而 LPS 刺激下，IκB-α发生磷酸化或被降解，NF-κB从NF-κB-IκB复合物解离并入核促进炎症因子基因发生转录，此时将释放大量的炎症因子［2，15］。本研究检测了氯喹对 LPS 诱导的 BV2 细胞中 IκB-α 和 NF-κB 蛋白表达水平的影响，结果显示预先给予氯喹能显著抑制LPS 刺激下BV2细胞中IκB-α 的降解，且能显著减少NF-κB 由胞浆向核内移位。由此可见，氯喹显著抑制LPS 诱导的BV2 细胞炎症反应，其机制与降低JNK 和p38 蛋白磷酸化水平及抑制NF-κB核内转移有关。

在LPS、缺氧、缺血等病理性刺激下，小胶质细胞膜表面的Toll 样受体如TLR4 表达会上调，从而激活MAPK 和 NF-κB 信号通路诱导炎症反应［2，14，16］。此外许多研究表明氯喹可通过抑制TLR4/MAPK、TLR4/NF-κB 信号通路从而抑制LPS 刺激下巨噬细胞的炎症反应［4，17］。因此，我们推断氯喹在BV2细胞中也可能是通过抑制 TLR4 介导的 MAPK、NF-κB 信号通路来减轻LPS 刺激下炎症反应的，这需要我们在后续实验中进一步证实。

虽然LPS 具有热稳定性和化学稳定性，但当前关于氯喹和LPS 在接触小胶质细胞之前是否存在相互作用后影响LPS 的活性及LPS 激活小胶质细胞的能力未知。这一点是本研究设计的缺陷，将在后续实验中进一步验证。

综上所述，氯喹能减少LPS 刺激下的BV2 细胞分泌促炎因子以减轻炎症反应，表明氯喹具有一定的神经保护作用，这将为后续治疗小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症性疾病提供相应的实验资料。