雌三醇对乙型肝炎病毒转录和复制水平的影响*

姚方龙， 任 放， 徐红艳， 姜 慧， 任吉华

（重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆400016）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是导 致急慢性肝炎的主要原因，并可逐步发展为肝硬化和肝癌，每年约有100 万人死于HBV 相关的各种终末期疾病，HBV 感染已成为严重威胁人类健康的世界性卫生难题［1-2］。目前，治疗乙型肝炎现症患者的主要药物包括干扰素和核苷类似物。由于HBV 逆转录酶缺乏保真性，病毒在复制过程中容易发生突变，而这些突变可能会降低干扰素的疗效，导致干扰素仅对不到30%的患者效果明显［3］。而且干扰素副作用较大，应用受到一定限制。核苷类似物长期用药可能产生病毒耐药问题［4-5］。因此要进一步改善乙肝现症患者的治疗效果，需要鉴定新型抗病毒作用因子。

HBV 感染及相关肝病普遍存在性别差异，流行病学表明男性血清中乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性率及其滴度明显高于女性［6］。HBV 携带者发病率是男性高于女性（10.7%vs4.4%）［7］，且男性 HBV 携带者的病毒载量也高于女性携带者［6］。慢性HBV 感染相关肝细胞癌的发病率也呈现出性别之间的分化，男女发病率之比大概在5∶1～7∶1［8］。有研究发现这种性别差异可能与性激素和免疫密切相关［9］。

性激素可以与免疫细胞核中的性激素受体相结合，通过固有免疫和获得性免疫影响HBV 的感染以及HBV 相关性疾病的发生发展［10］。研究发现雌激素更多地发挥免疫促进作用，而雄激素则发挥免疫抑制作用［10］。除此之外，性激素也可以直接作用于肝细胞上的雄激素受体和雌激素受体α，调控基因转录［11］。有研究表明，雄激素可促进雄激素受体与HBV 增强子Ⅰ中的两个雄激素反应元件结合，从而促进HBV 的复制［12-13］。雌二醇作用于肝细胞，可以诱导雌激素受体α 的合成，而雌激素受体α 可以与HBV 增强子Ⅰ竞争性结合转录因子肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α），从而抑制HBV 的转录功能［14］。而雌三醇（estriol，EST）作为雌激素中的一种，对HBV 复制的调控作用尚未见报道。因此，本课题组将利用稳定表达HBV 基因的HepG2.2.15 细胞 和 HBV 感染模型 HepG2-NTCP 细胞研究雌三醇对HBV转录和复制的调控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 细胞由本实验室保存。DMEM 培养液、胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco；G418购自Merck；MTS试剂盒购自Promega；RNA 提取试剂TRIzol 和逆转录酶购自天根生化科技有限公司；SYBR Green Master 购自Roche；HBsAg 和乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）ELISA 检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司；HBV 转基因小鼠（C57BL/6）为厦门大学夏宁邵教授所赠；天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 细胞的培养 HepG2.2.15 细胞培养于含10%胎牛血清和400 mg/L G418 的DMEM 培养液中，HepG2-NTCP 细胞培养于含10%胎牛血清和1 mg/L嘌呤霉素的DMEM 培养液中，所有细胞均在37℃、5%CO2孵箱中培养。

2.2 动物实验设计 HBV转基因小鼠（C57BL/6）饲养于无特定病原体的条件下。取15 只6 周龄、体重相近（20～22 g）且HBV DNA 水平相近的雄性HBV 转基因小鼠，随机分成3 组，即对照组、恩替卡韦（entecavir，ETV）组和雌三醇组，每组5 只。雌三醇粉末溶于DMSO，并用生理盐水稀释1 000 倍。结合文献报道［15］，在不损伤肝功能的前提下确定雌三醇组给药剂量为5 mg/kg，ETV组给药剂量为0.02 mg/kg，对照组注射含1‰DMSO 的生理盐水，采用腹腔注射的方式给药，每2 d给药一次。4周后，采用眼眶取血的方法收集小鼠血清，并处死小鼠，分离出肝脏。

2.3 HepG2-NTCP 细胞感染HBV 病毒粒子 HBV病毒粒子来源于HepAD38 细胞培养上清，经浓缩定量后，于-80℃分装保存。接种8×105个HepG2-NTCP细胞于预先用胶原铺板的6 孔板中，1 d 后用感染培养液换液，换液1 d 后感染HBV 病毒粒子，感染复数为 1 000，1 d 后弃去细胞培养上清，PBS 清洗 2 次后用感染培养基继续培养。

2.4 MTS 实验 接种 2×104个细胞于 96 孔板，第 2天加入不同浓度（从 640 μmol/L 到 5 μmol/L 倍比稀释）的雌三醇，3 d 更换一次培养液，第6 天在培养液中加入20 μL MTS 试剂盒中的溶解试剂，5% CO2、37℃孵育1 h后，490 nmol/L下读取吸光度。

2.5 RT-qPCR 检测HBV RNA 采用TRIzol 法裂解细胞提取总RNA，取1 μg RNA 按照逆转录试剂盒说明书将其逆转录cDNA，RT-qPCR 检测目的基因的mRNA 水平。反应条件为:94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃20 s，循环34次。HBV RNA 上游引物序列为5'-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3'，下游引物序列为5'-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3'；内参照 β-actin上游引物序列为5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'，下游引物序列为5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。每个样本均设3个复孔，每组实验重复3次。

2.6 RT-qPCR 检测HBV DNA 用0.5 mL裂解缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、1% NP-40 和2% sucrose］于37℃裂解细胞15 min，离心去除细胞碎片，加入5 μL 的 1 mol/L MgCl2和 4 μL的 1×105U/L DNase I，37℃孵育 4 h，加入 200 μL 35% PEG-8000，冰浴1 h；4℃、12 000×g离心5 min，弃上清；加入 500 μL 蛋白酶 K 消化液［0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 mmol/L EDTA］和终浓度为500 mg/L 的蛋白酶K，45℃孵育过夜后用酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，TE 缓冲液溶解HBV DNA。按照SYBR Green 说明书配制反应体系和设置反应条件。反应条件为:94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，循环39 次。细胞中HBV core DNA 的上游引物序列为5'-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3'，下游引物序列为5'-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3'；小鼠血清和肝组织中 HBV DNA 的上游引物序列为 5'-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3'，下游引物序列为5'-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3'。每个样本均设3 个复孔，每组实验重复3次。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 雌三醇对HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 细胞活力的影响

为了验证雌三醇对HBV 复制的影响，我们首先检测了雌三醇对HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 细胞的毒性。MTS 结果显示，雌三醇对HepG2.2.15 细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为 181.5 μmol/L，对 HepG2-NTCP 细胞的IC50为218.6 μmol/L，见图1。

Figure 1.Effect of estriol（EST）on the viability of HepG2.2.15（A）and HepG2-NTCP（B）cells measured by MTS assay.Mean±SD. n=3.图1 雌三醇对HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞活力的影响

2 雌三醇对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

在雌三醇IC50范围内，我们选取10、20 和40 μmol/L 雌三醇作用于HepG2.2.15 细胞，并以25 nmol/L ETV（据文献报道该浓度下ETV 显著抑制HBV 复制［15］）为阳性对照。6 d 后，RT-qPCR 结果显示，不同浓度雌三醇处理后，HepG2.2.15 细胞中HBV core DNA 水平分别下降37%、50%和65%（图2A），HBV RNA 水平分别下降19%、38%和54%（图2B）；ELISA 结果显示，细胞培养上清中HBsAg 水平分别下降16%、29%和36%，HBeAg 水平分别下降20%、33%和41%（图2C、D）。

3 雌三醇对HepG2-NTCP 细胞中HBV 复制的影响

牛磺胆酸钠共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）是 HBV 感染肝细胞的受体，HepG2-NTCP 细胞能够模拟自然状态下HBV 的复制过程。进一步，我们利用此模型研究了雌三醇对HBV 复制的影响。我们对感染HBV 的HepG2-NTCP 细胞分别用 10、20 和 40 μmol/L 雌三醇处理，并以25 nmol/L ETV 为阳性对照，6 d 后，RT-qPCR结果显示，HepG2-NTCP细胞中HBV core DNA水平分别降低27%、40%和57%（图3A），HBV RNA水平分别降低16%、32%和49%（图3B）；ELISA 结果显示，HBsAg 水平分别降低17%、26%和33%，HBeAg水平分别降低19%、31%和41%（图3C、D）。

Figure 2.Effect of estriol（EST）on HBV replication in HepG2.2.15 cells.HepG2.2.15 cells were cultured with EST（10，20 and 40 μmol/L）for 6 d，and entecavir（ETV，25 nmol/L）was used as positive control.A，B:HBV DNA and RNA levels were detected by RT-qPCR；C，D:the levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatants were determined by ELISA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 雌三醇对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

4 雌三醇在HBV转基因小鼠模型中的抗病毒效能

为了进一步证明雌三醇在体内对HBV 转录和复制的调控作用，我们研究了雌三醇对HBV 转基因小鼠中HBV 转录和复制水平的影响。雌三醇组小鼠血清中ALT 和AST 的水平与对照组相比无显著差异（图4A、B），表明雌三醇对小鼠肝脏无毒性影响。RT-qPCR 检测血清中 HBV DNA 水平及 ELISA 检测血清HBsAg 和HBeAg 水平的结果显示，与对照组相比，雌三醇组血清HBV DNA 水平下降58%，ETV 组血清HBV DNA 水平下降97%（图4C），雌三醇组血清HBsAg 和HBeAg 水平分别下降39%和37%，而ETV 组HBsAg 和HBeAg 水平变化无统计学显著性（图4D、E）。RT-qPCR 检测肝组织中 HBV DNA 和RNA 水平的结果显示，与对照组相比，雌三醇组和ETV 组HBV DNA 水平分别下降55%和98%（图4F），雌三醇组 HBV RNA 水平下降 46%，而 ETV 组HBV RNA水平变化无统计学显著性（图4G）。

讨 论

雌激素及雌激素受体在HBV 感染及相关肝病中的作用已比较明确［16-17］。存在于人体中的雌激素有3 种，包括雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇可通过上调雌激素受体的表达而抑制HBV 的转录活性，发挥抑制 HBV 复制的作用［18］，而雌三醇作为雌二醇的代谢产物，在HBV 复制和转录中的作用目前尚无报道。本研究首先利用HBV 稳定表达细胞模型HepG2.2.15 细胞和HBV 感染细胞模型HepG2-NTCP 细胞研究了雌三醇对HBV 复制的调控作用。在HBV 生活周期中，HBV 的复制过程首先由HBV 的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）转录成不同大小的HBV RNAs，并表达HBV蛋白，HBV RNAs 中的3.5 kb RNA 可作为模板逆转录形成HBV DNA。我们的细胞研究结果显示，在IC50范围内雌三醇明显下调了HBV RNA 和DNA 水平以及HBsAg和HBeAg分泌水平，并呈浓度依赖性，表明雌三醇在体外可显著抑制HBV 生活周期中的转录和复制过程。为了证实研究结果的可靠性，我们又利用HBV 转基因小鼠模型证实了雌三醇在体内也具有较强的抑制HBV 转录和复制的作用，这些研究结果充分证实了雌三醇对HBV 复制过程发挥负向调控作用。

Figure 3.Effect of estriol（EST）on HBV replication in HepG2-NTCP cells.After infected with HBV，HepG2-NTCP cells were cultured with EST（10，20 and 40 μmol/L）for 6 d，and entecavir（ETV，25 nmol/L）was used as positive control.A，B:HBV DNA and RNA levels were detected by RT-qPCR；C，D:the levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatants were determined by ELISA.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 雌三醇对HepG2-NTCP细胞中HBV复制的影响

Figure 4.Antiviral efficacy of estriol in HBV transgenic mice.The male transgenic mice were intraperitoneally injected with estriol（5 mg/kg），and entecavir（ETV，0.02 mg/kg）was used as positive control.A，B:ALT and AST levels were detected by ELISA；C:serum HBV DNA level was measured by RT-qPCR；D，E:the serum levels of HBsAg and HBeAg were tested by ELISA；F，G:liver HBV DNA and RNA level were analyzed by RT-qPCR.Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 雌三醇在HBV转基因小鼠模型中的抗病毒效能

经典的性激素发挥生理效应的过程是通过活化相应的激素受体受体，形成激素-受体复合体，从而发挥转录调控因子的作用，控制下游靶基因表达［19-20］。雌二醇也主要是通过上调雌激素受体的表达，抑制转录因子HNF4α 与HBV 增强子Ⅰ的结合，从而抑制HBV 的转录过程［10］。我们的研究结果证实，雌三醇可下调HBV RNA 水平、HBV 蛋白水平及HBV DNA 水平，结合雌二醇的作用机制，我们推测雌三醇可能抑制了HBV 的转录过程，进而抑制了HBV 的复制。下一步，我们将研究雌三醇对HBV 增强子和启动子活性的影响，筛选雌三醇调控HBV 增强子或启动子活性的转录因子，以阐明雌三醇调控HBV转录和复制的分子机制。

综上所述，雌三醇是一种HBV 复制过程的抑制因子，可能是通过下调HBV 转录水平而抑制了HBV的复制。