再生障碍性贫血患者CD4+T细胞中共刺激分子和免疫抑制受体的表达特点和意义*

郁 志 ， 黄桂璇， 张玉平， 陈小惠， 沈 琦， 陈存特，谭广销， 曹长姝， 李扬秋， 李 萡△

（1暨南大学附属第一医院血液内科，2暨南大学基础医学院血液学研究所，广东广州510632；3广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院血液内科，广东广州510180；4深圳市人民医院，暨南大学第二临床医学院血液内科，广东深圳518020；5暨南大学基础医学院解剖学系，广东广州510632）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种主要以T细免疫介导造血干/祖细胞破坏引起骨髓造血功能衰竭的血液系统疾病。AA 在我国发病率为7.4/106人，远远高于欧美国家［1］。

T 细胞活化需要双信号（第一信号和第二信号）共同作用。第二信号主要包括共刺激分子和免疫抑制受体，其中共刺激分子包括CD28、CD27、OX40、4-1BB、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）、可诱导T细胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）、疱疹病毒侵入介质（herpesvirus entry mediator，HVEM）等，免疫抑制受体包括程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）、细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、含T 细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，TIM-3）等［2-4］。这些正性或负性调控T 细胞活化的第二信号分子是保证恰当、有效T 细胞免疫应答的必要因素。

CD4+T细胞与AA 的发病有一定关系，目前有关AA 患者CD4+T细胞中第二信号分子的研究并不多，因此通过系统分析AA 患者CD4+T 细胞参与T 细胞活化调控第二信号分子的特点将为全面了解AA 的T细胞免疫发病机制提供基础研究数据。

材 料 和 方 法

1 样本资料

共收集12 例健康成人（healthy individuals，HI）外周血（其中男性8 例，女性4 例，中位年龄38 岁）作为对照组，16 例AA 患者［包括5 例非重型再生障碍性贫血（non-severe aplastic anemia，NSAA）、5 例重型再生障碍性贫血（severe aplastic anemia，SAA）和6例极重型再生障碍性贫血（very severe aplastic anemia，VSAA），其中男性9 例，女性7 例，中位年龄30 岁］外周血作为实验组。收集这些外周血样本时已告知本人，并通过暨南大学附属第一医院伦理委员会批准。

2 主要试剂与仪器

CD3-FITC（HIT3a）、CTLA-4-BV421（BNI3）、GITR-PerCP/Cy5.5（108-17）和HVEM-APC（TR2）抗体购自 BioLegend；CD4-APC-H7（RPA-T4）、OX40-PE（ACT35）、4-1BB-BV421（4B4-1）、ICOS-PE（DX-29）、TIM-3-Alexa Fluor（7D3）和 LAG-3-PE（T47-530）抗体购自BD Biosciences；红细胞裂解液购自BD Biosciences；细胞染色缓冲液购自BioLegend。FACSVerse流式细胞仪为BD Biosciences产品.

3 流式细胞术检测

3.1 CD4+T 细胞中共刺激分子检测 根据本实验室流式细胞术检测常规方法，配制预混液等试剂后［5］，分别取2个流式管（A:对照管；B:全染管），每管加入 200 μL 的健康人或 400 μL 的 AA 患者外周血，各管中加入相当于10 倍外周血体积的红细胞裂解液，混匀，室温避光放置10 min，随后使用350×g离心 5 min。弃上清，加入 2 mL 的 1× PBS 洗涤，350×g离心5 min，弃上清，重复一次。弃上清，加入50 μL的细胞染色液缓冲液重悬细胞，形成单细胞悬液，在A 管中加入配好的抗体预混液（包含有流式抗体CD3 1 μL，CD4 1 μL，OX40-ISO 20 μL，GITR-ISO 5 μL，4-1BB-ISO 5 μL，ICOS-ISO 20 μL，HVEM-ISO 20 μL）；同样，在B 管中加入抗体预混液（包含流式抗体 CD3 1 μL，CD4 1 μL，OX40 20 μL，GITR 5 μL，4-1BB 5 μL，ICOS 20 μL，HVEM 20 μL）；轻轻混匀，室温下避光孵育20 min。上述流式管中加入2 mL 的 1× PBS，350×g离心 5 min，弃上清，再重复一次。弃上清，据细胞数情况在管中加入300～500 μL的细胞染色缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪检测细胞。

3.2 CD4+T 细胞中免疫抑制受体检测 该检测中外周血红细胞裂解及单细胞悬液制备方法同上。在A 管中加入抗体预混液（包含流式抗体CD3 1 μL 和CD4 1 μL）；同样，在B 管中加入抗体预混液（包含流式抗体CD3 1 μL，CD4 1 μL，TIM-3 5 μL，CTLA-4 5 μL，LAG-3 5 μL）；轻轻混匀，室温下避光孵育20 min（TIM-3、LAG-3 和 CTLA-4 的流式圈门选用 FMO对照）。之后洗涤及重悬细胞流式细胞仪检测细胞步骤同上。收集CD4+T细胞中共刺激分子和免疫抑制受体流式细胞术检测原始数据后，采用FlowJo 软件（Becton，Dickinson and Company）进行分析。

4 统计学处理

使用SPSS 25.0 进行统计学分析。各组数据均用箱图（box plot）表示:箱（box）中的横线表示中位数（median）；箱的上、下边（ends）分别表示上、下四分位数（quartiles）；上、下误差线（whiskers）分别表示最大值（maximum）和最小值（minimum）。组间差异采用非参数秩和检验（Mann-Whitney 检验）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AA患者外周血CD4+T细胞中共刺激分子比例

12 例健康人外周血中CD4+T 细胞中OX40、ICOS、4-1BB、GITR 和 HVEM 的比例依次为 3.26%、2.40%、1.39%、25.95%和49.60%；16 例AA 患者（5例 NSAA、5 例 SAA 和 6 例 VSAA）外周血 CD4+T 细胞上述信号分子的比例依次为8.01%、2.44%、1.16%、11.55%和82.20%。AA患者外周血中CD4+OX40+T细胞比例显著高于健康人，而CD4+GITR+T 细胞的比例显著低于健康人（P＜0.01）；不同病情程度AA 患者CD4+GITR+T 细胞比例均显著低于健康人（P＜0.05）；SAA 和 VSAA 患者 CD4+OX40+T 细胞比例均显著高于健康人（P＜0.05）；VSAA 患者CD4+HVEM+T细胞显著高于健康人（P＜0.05），见图1。

2 AA患者外周血CD4+ T细胞免疫抑制受体比例

健康人外周血 CD4+T 细胞中 TIM-3、LAG-3 和CTLA-4 的比例依次为4.47%、1.37%和4.27%；而AA 患者外周血CD4+T 细胞的比例依次为7.85%、1.72%和5.38%。AA 患者外周血CD4+T 细胞中TIM-3、LAG-3 和CTLA-4 的比例与健康人相比均无显著差异，不同病情程度AA 患者与健康人，以及不同病情程度AA 患者之间上述分子的表达亦无显著差异，见图2。

讨 论

目前普遍认为AA 是异常T 细免疫介导的自身免疫性疾病，多项研究表明AA 中存在异常T 细胞活化［6］。T 细胞活化需要双信号，其中第二信号又包括共刺激分子和免疫抑制受体，这是两类执行不同调控功能的信号分子。共刺激分子促进T 细胞活化，而免疫抑制受体起到“刹车”的作用，控制T 细胞不发生过度活化。因此，二者之间的平衡可保证机体的正常T 细胞免疫功能，这个平衡一旦打破，将会引起T 细胞免疫缺陷或T 细胞免疫亢进［7］。我们前期研究也发现AA 患者外周血中与T 细胞活化的TCR/CD3复合物各组成基因（CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ）和第二信号分子CD28 的mRNA 表达升高并参与调控转录后调控机制对CD3ζ表达影响［8-10］。

CD4+T 细胞又称辅助性T 细胞，其主要功能是促进B 细胞、T 细胞和其它免疫细胞增殖和分化，协调不同类型免疫细胞之间的相互作用。根据所分泌细胞因子的不同特点，CD4+T 细胞大致可以分为Th1、Th2、调节性 T 细胞和Th17 细胞亚群，最近还检测到 Th9、Th22 和 Tfh 等细胞亚群［11］。AA 中异常CD4+T 细胞研究发现Th1 免疫格局偏移，调节性T 细胞数量和功能异常以及Th17 细胞数量异常等［12-14］。有关AA 中CD4+T 细胞异常T 细胞活化第二信号分子的研究不多，我们前期研究也提示不同病情程度AA 患者 CD4+CD27+T 细胞比例均显著升高［15］。有报道显示 AA 患者 CD4+PD-1+T 细胞的比例升高［16］。因此，本研究全面分析了AA患者中CD4+T细胞多种第二信号分子的变化。

OX40 属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要在活化的T 细胞上表达，在CD4+T 细胞上表达更高。OX40 与其配体OX40L 识别后，促进T 细胞增殖和存活［17］。本研究结果表明 AA 患者 CD4+OX40+T 细胞比例显著高于健康人，而且在SAA 和VSAA 患者中更高，结果说明AA 患者CD4+T 细胞中OX40 可能与T细胞过度活化有关。

Figure 1.The expression features of co-stimulatory molecules in peripheral blood CD4+ T cells of AA patients.A:the logic diagram of flow cytometry for detecting CD4+ OX40+，CD4+ ICOS+，CD4+ 4-1BB+，CD4+ GITR+ and CD4+ HVEM+ T cells；B:the proportion of CD4+ OX40+，CD4+ ICOS+，CD4+ 4-1BB+，CD4+ GITR+ and CD4+ HVEM+ T cells in peripheral blood of healthy individuals（HI）and AA patients；C:the proportion of CD4+OX40+，CD4+ICOS+，CD4+4-1BB+，CD4+GITR+and CD4+HVEM+T cells in peripheral blood of HI and different degree of AA patients.The data were expressed as box plot，including median，first quartile，third quartile，minimum and maximum. n=12 in HI group；n=16 in AA group（n=5 in NSAA and SAA，n=6 in VSAA）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI group.图1 AA患者外周血CD4+T细胞共刺激分子的表达

Figure 2.The expression features of immune inhibitory receptors in peripheral blood CD4+ T cells of AA patients.A:the logic diagram of flow cytometry for detecting CD4+ TIM-3+，CD4+ LAG-3+ and CD4+ CTLA-4+ T cells；B:the proportion of CD4+TIM-3+，CD4+LAG-3+and CD4+CTLA-4+T cells in peripheral blood of healthy individuals（HI）and AA patients.The data were expressed as box plot，including median，first quartile，third quartile，minimum and maximum. n=12 in HI group；n=16 in AA group.图2 AA患者外周血CD4+T细胞中免疫抑制受体的表达

HVEM 也属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，HVEM 高水平表达于初始和活化的T 细胞。根据所结合的配体不同，HVEM 对T 细胞活化的调控起到“双面”调节作用，既可以发挥正性调控，也可以发挥负性调控。HVEM 在T 细胞上与LIGHT 结合是促进T 细胞活化，而与 CD160 和 BTLA 的结合则抑制 T 细胞活化［18］。本研究仅在VSAA 患者中观察到CD4+HVEM+T 细胞比例显著高于健康人，至于HVEM 在VSAA 患者中异常T 细胞活化中的具体作用，需要今后从其所结合的配体去探讨。

GITR 同样属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。初始T 细胞上GITR 表达水平不高，T 细胞活化24 h后GITR 表达迅速增加。GITR 与其配体GITRL 促进T 细胞活化/分化及存活，而且还可参与介导白细胞黏附和迁移［19］。此外，GITR 在调节性T 细胞中组成性表达，调节T 细胞中GITR 与一些自身免疫性疾病有关［20］。本研究检测显示不同病情程度AA 患者CD4+GITR+T 细胞比例均显著降低，这首先说明CD4+GITR+T 细胞比例下降是所有AA 患者的一个共性变化特点。另外，结合有关AA 患者调节性T 细胞中 GITR 未见明显改变的报道［21］，也说明 AA 患者CD4+GITR+T 细胞比例降低可能主要发生在其他CD4+T 细胞亚群，比如 Th1、Th2 或者 Th17 细胞亚群。鉴于这些T 细胞亚群在AA 中特点，我们下一步将主要分析Th1 细胞亚群中GITR 的特点，以期最终明确AA 患者CD4+T 细胞中GITR 在异常T 细胞活化中的作用。

AA 患者中其他共刺激信号分子，如4-1BB 和ICOS，以及免疫抑制受体CTLA4、LAG-3、TIM-3 并未发生显著变化。但是我们观察到所分析的3 个免疫抑制受体呈现升高的趋势。本研究所分析的共刺激分子和免疫抑制受体的结果间接提示AA 患者异常CD4+T 细胞活化可能与某些共刺激信号分子，如OX40、HVEM和GITR等密切相关。由于本研究所涉及样本例数不多，今后需要进一步加大样本量观察上述参与T 细胞活化调控分子在AA 患者CD4+T 细胞中的特点。同时SAA 和VSAA 患者中CD4+OX40+T 细胞比例升高，以及HVEM 在VSAA 患者中的特点也说明不同病情程度AA 患者中共刺激分子存在差异变化特点，通过对T 细胞活化第二信号分子的分析，明晰不同病情程度AA 患者的特征性改变，为今后临床AA 免疫抑制治疗疗效评估也提供了一些参考资料。另外，我们将跟踪分析经免疫抑制治疗后AA 患者共刺激分子和免疫抑制受体的变化，也为免疫抑制治疗后AA 患者上述信号分子的变化特点积累基础资料。总之，本研究首次报道了AA 患者CD4+T 细胞中参与调控T 细胞活化的多个第二信号分子的情况（总结示意图见图3），为今后更为全面了解AA 中CD4+T 细胞异常免疫状态提供了新的基础研究资料。

Figure 3.The schematic diagram of expression of co-stimulatory molecules and immune inhibitory receptors in CD4+ T cells from AA patients.图3 AA患者CD4+T细胞共刺激分子和免疫抑制受体表达情况示意图