穿心莲内酯联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎大鼠抗炎及保肝效果观察

罗沙沙，李芬芬，谢小倩，王亚乐，赵则月，李晓天

1)郑州大学药学院 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院病理生理学教研室 郑州 450001

类风湿关节炎是一种以对称性、持续性关节肿胀和疼痛为主要表现的慢性自身免疫性疾病[1]。目前临床上均推荐甲氨蝶呤作为治疗类风湿关节炎的首选药物[2]，但长期使用会产生不良反应，如肝脏损伤。穿心莲内酯是具有保肝利胆、解热抗炎等作用的二萜内酯类化合物。目前有研究[3]发现穿心莲内酯可以减少炎性细胞因子产生，对类风湿关节炎有治疗作用。已有文献[4]报道穿心莲内酯具有抗肝毒性作用。肝毒性是甲氨蝶呤长期治疗关节炎的常见不良反应[5]，如血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量增加[6]。本研究采用穿心莲内酯联合甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎大鼠，观察治疗效果，并通过检测血清中AST和ALT含量评价穿心莲内酯对甲氨蝶呤诱导肝损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1药品、试剂及仪器YLS-6B智能热板仪(山东省医学科学院设备站)，生理盐水(石家庄四药有限公司)，弗氏完全佐剂(10 g/L,北京博蕾德生物科技有限公司)，穿心莲内酯与甲氨蝶呤(大连美伦生物技术有限公司)，AST与ALT检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2实验分组及处理雄性Wistar大鼠32只，体重(140±20) g，大鼠及饲料均购于河南省实验动物中心(动物合格证编号：ZYXY 2017-0005)；采用标准饲料及饮用水喂养，温度20～25 ℃，湿度55%～65%，光照12 h/d。动物垫料每周更换2次，喂养过程按照清洁级实验动物的操作规程来进行。适应性喂养1周后，体积分数75%乙醇消毒，于大鼠右后足皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL，然后采用随机数字表法将大鼠分为对照组、甲氨蝶呤组、穿心莲内酯组、联合组，每组8只。第11～38天，甲氨蝶呤组大鼠每周2次腹腔注射甲氨蝶呤溶液5 mL/kg(0.2 g/L甲氨蝶呤的给药剂量为 2 mg/kg[7])，穿心莲内酯组大鼠每天灌胃穿心莲内酯溶液10 mL/kg(5 g/L穿心莲内酯溶液给药剂量为50 mg/kg[8])，联合用药组大鼠除每周2次腹腔注射甲氨蝶呤溶液外每日灌胃给予穿心莲内酯溶液10 mL/kg，对照组大鼠每天灌胃等体积的5 g/L羧甲基纤维素钠溶液。在第38天测量大鼠足厚度、足周长、关节炎指数(AI)、热板实验耐受时间；第39天，各组大鼠麻醉后取血分离血清用于血清中AST、ALT含量的测定，处死大鼠后取右后肢踝关节组织用于HE染色。

1.3大鼠类风湿关节炎的评估

1.3.1 足厚度及足周长的测定 将大鼠置于足趾测量仪配套大鼠固定架中，使用游标卡尺、软尺分别测量右后足足厚度和足周长，平行测量3次取均值。

1.3.2 后肢AI测定 观察大鼠关节活动情况，并对大鼠后肢进行AI测定。评分标准：关节正常，0分；关节或足趾发红，1分；关节或足趾发红、轻度肿胀，2分；关节或足趾重度肿胀，3分；关节变形、强直，4分。结果取两后肢评分之和，最高8分。

1.3.3 热板实验耐受时间测定 捉持大鼠让大鼠右后足足底接触温度为(52.0±0.2) ℃热板，大鼠受热刺激而产生明显的后抽动作作为疼痛的反应指标，记录大鼠产生痛反应所需时间。每只大鼠平行测试2次取均值，每次测试间隔不应小于15 min。

1.4大鼠血清AST、ALT测定麻醉大鼠，腹主动脉取血，血样静置30 min后于离心机上3 000 r/min离心15 min，取血清置于-80 ℃冰箱中储存待用。利用AST、ALT检测试剂盒测定血清中AST、ALT含量，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.5大鼠踝关节组织HE染色处死大鼠后，取大鼠右后肢踝关节浸泡于体积分数10%甲醛溶液中固定过夜，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋， 4 μm厚切片，二甲苯脱蜡，HE染色，在显微镜下观察。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析，不同组间大鼠足厚度、足周长、AI、耐受时间、血清AST及ALT含量的比较均采用2×2析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠类风湿关节炎指标的比较见表1。甲氨蝶呤及穿心莲内酯均可改善大鼠足厚度、足周长、AI及耐受时间等指标；两药联用可表现出协同作用，进一步减少大鼠足周长，延长耐受时间。

表1 各组大鼠类风湿关节炎指标的比较

2.2各组大鼠血清中AST及ALT含量的比较结果见表2。由表2可知，甲氨蝶呤单独使用升高大鼠血清中AST、ALT含量，穿心莲内酯单独使用降低大鼠血清中AST、ALT含量；两药联用，可表现出拮抗作用。

表2 各组大鼠血清AST及ALT含量的比较U/L

2.3各组大鼠踝关节组织HE染色结果对照组大鼠踝关节炎性细胞浸润严重，滑膜增厚，关节腔隙狭窄，软骨侵蚀(图1A)；甲氨蝶呤组及穿心莲内酯组大鼠关节腔未见滑膜增厚，软骨侵蚀情况较轻(图1B、C)；联合组大鼠踝关节边缘较清晰，炎性细胞明显减少，未见滑膜增厚(图1D)。

A：对照组；B：甲氨蝶呤组；C：穿心莲内酯组；D：联合组

3 讨论

类风湿关节炎是一种常见的慢性关节破坏性炎症疾病，以滑膜增生、炎性细胞浸润及出现新生血管等为特征[9]。本研究通过析因设计，探讨甲氨蝶呤、穿心莲内酯两药的相互作用，研究证实甲氨蝶呤及穿心莲内酯均能改善大鼠类风湿关节炎指标，如足厚度、足周长、AI、耐受时间，且两药存在交互作用，穿心莲内酯可以增强甲氨蝶呤的抗炎作用，减轻类风湿关节炎炎症状态；本研究发现，甲氨蝶呤单独使用，大鼠血清AST、ALT含量均升高；穿心莲内酯单独使用，大鼠血清AST、ALT含量均降低，且两药联用表现出相互拮抗作用，说明穿心莲内酯可改善类风湿关节炎治疗中甲氨蝶呤引发的肝毒性。

有研究[10]表明，穿心莲内酯可以通过抑制NF-κB和激活Nrf2信号通路来保护肝脏；且穿心莲叶的乙醇提取物可以预防硫代乙酰胺诱导的大鼠肝硬化，与其降低活性氧水平有关[11]。近期研究[12]表明，大黄酸可以在mRNA和蛋白质水平下调促细胞凋亡基因bax的表达，通过Nrf2-HO-1途径改善甲氨蝶呤介导的肝损伤；小檗碱可以清除活性氧物质，改善氧化应激反应，抵抗甲氨蝶呤诱导的大鼠肝毒性[13]。进而推测穿心莲内酯治疗甲氨蝶呤诱发的肝毒性，可能与其抗炎抗氧化药理活性有关。

本研究建立弗氏完全佐剂诱导的Wistar大鼠类风湿关节炎模型，发现穿心莲内酯不仅可以治疗类风湿关节炎，还能减弱甲氨蝶呤的肝毒性。