咖啡酸对食管鳞状细胞癌KYSE150细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠移植瘤生长的影响

孙晓萌，齐义军，高社干

1)河南科技大学第一附属医院肿瘤医院 河南洛阳 471003 2)河南省肿瘤表观遗传学重点实验室 河南洛阳 471003

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第7位和第6位[1]。组织学上，约88%的食管癌为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。由于ESCC早期症状不典型，约80%的ESCC患者就诊时已发展到临床晚期，5 a生存率仅为10%～15%[3]。目前，姑息性放化疗是晚期ESCC的主要治疗方案，然而疗效并不理想，亟须筛查ESCC特异性靶向药物。鳞状细胞癌扩增基因1(gene amplified in squamous cell carcinoma 1, GASC1)是第一个从ESCC细胞系扩增识别的癌基因[4]。GASC1高表达于ESCC干细胞ALDHbri+亚群，并与ESCC低分化、淋巴结转移、生存期差等恶性肿瘤特征密切相关[5-6]。Cheung等[7]筛选了640个自然产物文库，发现咖啡酸是有效的GASC1抑制剂之一。咖啡酸是有机酸中的酚酸类物质之一，广泛存在于多种食物以及中草药中[8]。咖啡酸不仅具有抗炎、镇痛、免疫调节等功能，而且还有抗肿瘤作用[9-10]。本研究探讨了GASC1抑制剂咖啡酸对ESCC细胞KYSE150增殖、侵袭和转移能力以及裸鼠移植瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1材料15只6～8周龄雄性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物垫料、饲料购自舒克贝塔公司。KYSE150细胞由河南省肿瘤表观遗传学重点实验室保存。RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、青链霉素混合液购自索莱宝公司。咖啡酸购自MCE公司，纯度≥98%，以DMSO配制为储存液，-20 ℃保存。CCK-8试剂盒购自日本东仁化学科技有限公司(上海)，DMSO购自Sigma公司，含有基质胶和不含基质胶的Transwell小室分别购自Corning公司、BD公司。倒置显微镜购自Nikon公司，全自动酶标仪、细胞培养箱购自Thermo公司。

1.2细胞培养KYSE150细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中常规培养，至80%融合时传代或冻存。

1.3不同浓度咖啡酸对细胞增殖能力的影响取对数生长期的KYSE150细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，按100 μL/孔接种于96孔板。用5、10、20、50 μmol/L的咖啡酸分别处理KYSE150细胞，对照组细胞以DMSO处理，每组设置3个平行孔，并设置只含培养基的空白调零孔。于处理后12、24、48、72、96 h，每孔加入10 μL CCK-8，避光混匀后置于培养箱中孵育1～4 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。实验重复3次。

1.4咖啡酸处理后细胞迁移、侵袭能力检测用20 μmol/L咖啡酸处理细胞96 h后，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，加无血清培养基重悬计数，将300 μL含7.5×104个细胞的细胞悬液接种于不含基质胶的Transwell小室上室或将300 μL含1×105个细胞的细胞悬液接种于含有基质胶的小室上室，小室下室均加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基750 μL，置于培养箱中分别培养24、36 h，取出小室，结晶紫染色，棉签擦除小室上层细胞，倒置显微镜下观察，选取5个视野(×100)，计数细胞。实验重复3次。

1.5咖啡酸处理后裸鼠移植瘤体积和质量的检测收集处于对数生长期、荧光素酶标记的KYSE150细胞(Luc-KYSE150细胞)，于裸鼠肩背部皮下接种100 μL PBS重悬的Luc-KYSE150细胞约3×106个。2周后观察皮下成瘤情况，然后随机分为3组：对照组、低浓度咖啡酸组和高浓度咖啡酸组(咖啡酸浓度参照文献[11])，每组5只，分别给予100 μL质量浓度为3 g/L的羟甲基纤维素钠、以3 g/L羟甲基纤维素钠溶解的咖啡酸50 mg/kg或100 mg/kg腹腔注射，1次/d，共4周。期间每周测量瘤体大小，计算肿瘤体积(V=ab2/2，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)。4 周后用小动物成像仪进行皮下瘤成像，然后脱颈处死裸鼠，剥离皮下瘤，称取质量。

1.6统计学处理采用SPSS 24.0处理数据。应用5×5析因设计的方差分析评估不同浓度的咖啡酸处理不同时间对KYSE150细胞增殖的影响，应用两独立样本t检验比较对照组和咖啡酸组KYSE150细胞侵袭和迁移细胞数的差异，应用重复测量数据的方差分析比较对照组、低浓度咖啡酸组和高浓度咖啡酸组裸鼠肿瘤体积的差异，应用单因素方差分析比较接种4周后对照组、低浓度咖啡酸组和高浓度咖啡酸组裸鼠肿瘤质量的差异，两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1咖啡酸对KYSE150细胞增殖的影响不同浓度咖啡酸均能抑制KYSE150细胞的增殖，且随着药物浓度增加，抑制作用增强，50 μmol/L咖啡酸几乎导致KYSE150细胞增殖停滞(表1)。

表1 咖啡酸对KYSE150细胞增殖的影响(n=3)

2.2咖啡酸对KYSE150细胞迁移及侵袭能力的影响20 μmol/L咖啡酸处理KYSE150细胞96 h后，侵袭和迁移细胞数减少(表2)。

表2 咖啡酸对KYSE150细胞迁移及侵袭能力的影响

2.3咖啡酸对裸鼠皮下移植瘤生长的影响随着浓度的增加，咖啡酸的抑瘤作用增强(表3)；此外，低、高浓度咖啡酸组裸鼠皮下肿瘤质量分别为(0.45±0.07) g和(0.38±0.07) g，均低于对照组[(0.55±0.07) g],且高浓度咖啡酸组更低(F=8.443,P=0.005)。

表3 3组裸鼠皮下肿瘤体积比较 mm3

3 讨论

食管癌是发生于食管黏膜上皮组织的一种常见的消化道恶性肿瘤，随着环境、饮食、生活习惯等多种易感因素的变化，以及人口基数和老龄化趋势，ESCC的发病人数逐渐增加。最新一次中国癌症统计数据[9]显示ESCC发病率及病死率在我国恶性肿瘤中分别居第3位和第4位。ESCC早期症状不明显，大部分患者发现时已进展为晚期，失去了根治性手术的机会，姑息性同步放化疗的效果有限，尤其重要的是，目前缺乏ESCC特异性靶向治疗药物。

GASC1定位于9p23-24，是组蛋白赖氨酸去甲基化酶4(histone lysine demethylases 4, KDM4)家族成员之一，又称KDM4C、JMJD2C[4]。GASC1编码的核蛋白具有Jumonji C结构域，能够催化组蛋白第9位和第36位赖氨酸(H3K9、H3K36)去甲基化来调控甲基化水平[10-13]，进而参与影响肿瘤干细胞的自我更新和分化。肿瘤干细胞或者肿瘤起始细胞是肿瘤发生、进展、放化疗抵抗及复发的起源细胞，属于肿瘤细胞群体中具有特殊生物学功能的细胞亚群[14-16]，具有自我更新、多向分化、恶性增殖、肿瘤重建等生物学特性。我们课题组已筛选出ALDHbri+ESCC肿瘤干细胞亚群，并发现该亚群GASC1高表达，敲除GASC1后ALDHbri+ESCC亚群细胞恶性增殖、自我更新、体内成瘤等干细胞生物学特性均受到抑制，表明GASC1参与ESCC肿瘤干性的维持[6]。此外，作者所在课题组又通过免疫组化的方法检测了82例确诊为原发性ESCC的患者标本，结果显示ESCC组织中GASC1高表达与ESCC患者低分化、有淋巴结转移、生存期差等临床病理学特征呈正相关[5]。因此，推断GASC1是潜在的食管癌分子治疗靶点。

咖啡酸存在于食物及中草药中[8]，咖啡酸的药理作用有抗氧化、免疫调节、抗炎等，还能够发挥升白细胞、血小板及止血等作用[17-18]。近期研究[19-22]发现，咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙酯具有抑制多种肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，促进肿瘤细胞凋亡等功能。本研究结果发现，咖啡酸能够呈浓度依赖性抑制ESCC细胞KYSE150的生长；20 μmol/L咖啡酸可抑制KYSE150细胞迁移、侵袭能力。裸鼠荷瘤实验亦证实，与对照组相比，高、低浓度咖啡酸组裸鼠皮下肿瘤体积减小，质量降低，证实了咖啡酸对ESCC细胞具有抗肿瘤作用。

综上所述，咖啡酸能够抑制ESCC细胞KYSE150增殖、迁移、侵袭及裸鼠皮下移植瘤生长等恶性生物学行为，为咖啡酸的临床应用提供了实验依据。