河南汉族人群mir-34b/c基因rs4938723多态性与结直肠癌遗传易感性及预后的关系

徐纪中，袁维堂，王贵宪，周全博，胡晟云

郑州大学第一附属医院结直肠肛门外科 郑州 450052

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一。据统计[1]全球每年CRC新发病例约150万，我国约占20%，且我国CRC发病率占所有恶性肿瘤第6位，目前随着人们饮食结构的改变及生活节奏的加快，发病率仍呈上升趋势，给人们的生命健康造成严重威胁。近年来研究[2]表明，微小RNA(miRNA)表达或功能异常与CRC发生、发展关系密切，部分miRNA已被视为抑癌基因或癌基因。研究[3-4]发现，mir-34b/c在CRC中的表达呈现个体差异性、组织差异性及种族差异性，具有单核苷酸多态性，参与调控GATA-X、p53、Bcl-2等多种靶基因及其相关信号通路基因，通过干扰靶基因功能而改变生物学过程，与CRC遗传易感性及预后关系密切。目前关于mir-34b/c单核苷酸多态性与CRC遗传易感性及疾病预后关系的研究尚鲜有报道。本研究对180例接受根治性切除术治疗的河南汉族CRC患者mir-34b/c基因rs4938723多态性与CRC遗传易感性及术后生存状况的关系进行了分析，报道如下。

1 对象与方法

1.1一般资料收集2014年7月至2016年7月我院收治的180例CRC患者(CRC组)的资料。病例纳入标准：①均接受根治性切除术，且术后病理检查确诊为CRC。②参照中华医学会指南[5]，术后根据肿瘤性质制定抗癌综合治疗方案，包括放化疗、免疫治疗等。③患者间无血缘关系。④均为河南籍汉族人。⑤卡式行为状态评分[6]≥70分。⑥患者均签署知情同意书。排除标准：①合并严重肝肾功能不全者。②术前接受放疗、生物靶向治疗者。③合并肛管癌、家族性结肠腺瘤性息肉病恶变者或其他部位原发性恶性肿瘤者。④妊娠期或哺乳期妇女。⑤精神状态异常者。CRC患者中男105例，女75例；年龄28～75(63.2±10.5)岁；结肠癌95例，直肠癌85例；美国癌症联合会(AJCC)分期[7]Ⅰ期34例，Ⅱ期82例，Ⅲ期49例，Ⅳ期15例。另选取同期我院体检中心180名体检健康人群(对照组)，其中男108例，女72例；年龄30～70(62.5±10.2)岁。该研究获我院伦理委员会审批。

1.2mir-34b/c基因rs4938723多态性检测取术前CRC患者和健康受试者空腹静脉血4 mL，加入抗凝管。取抗凝血0.5 mL，与等量细胞裂解液混匀，离心后取沉淀，加入250 μL酚/氯仿混合液充分混匀，离心取上清，与等体积氯仿充分混匀，再次离心取上清，加入无水乙醇充分混匀，离心后弃去上清，重复无水乙醇操作，室温风干，-20 ℃备用。 采用PCR-RFLP法检测mir-34b/c基因rs4938723多态性：参照PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书操作，扩增目的片段。mir-34b/c rs4938723引物序列：F为5’-ATGCTAAACGCTAGTCATGC-3’，R为 5’-ATTGCTGTAGTCTGATGCTT-3’。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，42个循环；然后72 ℃延伸5 min。设定RELP反应体系：PCR产物4.0 μL，Buffer缓冲液1.0 μL，Hind Ⅲ限制性内切酶1.0 μL，ddH2O 9.0 μL，37 ℃水浴酶切，产物送上海生工测序验证。酶切产物进行30 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照。野生纯合型(TT)为1个条带，突变杂合型(TC)为3个条带，CC型为2个条带。基因分型成功率100%。

1.3临床资料的收集及随访收集对照组及CRC患者术前临床资料，包括性别、年龄、体质指数(BMI)、吸烟史(吸烟>5支/d，烟龄≥5 a)、饮酒史(饮酒量>40 g/d，酒龄≥5 a)、AJCC分期及mir-34b/c基因型。以病例查询或电话随访方式明确CRC患者生存状况，术后至少每3个月随访1次，随访截止时间为2019年7月，终点事件为结直肠癌导致的死亡。

1.4统计学处理应用SHEsis软件对对照组mir-34b/c基因rs4938723基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用SPSS19.0分析处理数据，CRC组和对照组性别、饮酒史、吸烟史的比较采用χ2检验，年龄、BMI的比较采用两独立样本的t检验；应用Kaplan-Meier法对不同基因型CRC患者绘制生存曲线并进行log-rank检验，采用Cox回归模型分析mir-34b/c基因型与CRC预后的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CRC组与对照组一般资料的比较见表1。结果显示CRC组与对照组性别、年龄、BMI、饮酒史、吸烟史比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 CRC组与对照组一般资料的比较

2.2CRC组与对照组mir-34b/c基因rs4938723基因型及等位基因频率的比较对照组mir-34b/c基因rs4938723基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.293,P=0.134)，提示本研究所选群体代表性良好。CRC组C等位基因频率高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 2组mir-34b/c rs4938723基因型及等位基因频率比较 例(%)

2.3不同基因型CRC患者生存曲线的比较随访时间36～54个月，Kaplan-Meier生存曲线见图1。结果显示TT基因型与TC+CC基因型患者生存曲线比较，差异有统计学意义(χ2=9.283，P=0.038)，TC+CC基因型患者的预后差于TT基因型患者。

图1 不同基因型CRC患者的生存曲线

2.4mir-34b/c基因rs4938723多态性与CRC预后的关系以性别(女为0，男为1)、年龄(<60岁为0，≥60岁为1)、饮酒史(无为0，有为1)、吸烟史(无为0，有为1)、BMI(以18.5～23.9 kg/m2为对照进行哑变量化)、AJCC分期(以Ⅰ期为对照进行哑变量化)为调整变量，以基因型(以TT基因型为对照进行哑变量化)为自变量，进行Cox回归分析，结果(表3)显示，TC、CC型是CRC 预后不良的危险因素。

表3 Cox回归分析结果

3 讨论

CRC发病机制十分复杂，近年来随着分子遗传学、分子生物学技术的不断发展，人们发现机体长期暴露于环境、饮食等多种致癌因素时，CRC发病风险升高，但仍存在个体差异，可能与遗传基因突变导致易感性增加有关[8-10]。mir-34b/c基因参与机体多种病理、生理反应，其启动子区多态性与该基因功能关系密切[11-12]。rs4938723位点位于mir-34b/c基因CpG岛，可能通过与Notch1碱基互补配对结合，从而激活或抑制Notch1信号通路，调控肿瘤细胞的增殖、分化过程[13]。p53基因具有修复细胞基因缺陷、防止癌变、促进癌变细胞凋亡的功能，是重要的抑癌基因。mir-34家族是抑癌基因p53的直接靶基因，mir-34家族基因表达和功能异常可直接影响p53介导的信号通路异常，导致细胞癌变风险增加[14]。GATA-X基因是含锌指结构组织中特异性表达的转录因子，该基因失活可导致细胞无限分裂增殖，导致肿瘤的发生。研究[15]表明，mir-34b/c基因突变可引起GATA-X基因功能异常，可能导致CRC发病风险增加。本研究结果显示，河南汉族CRC患者mir-34b/c基因rs4938723的突变的C等位基因分布频率升高，提示mir-34b/c基因rs4938723多态性与河南汉族人群CRC遗传易感性关系密切，推测与rs4938723位点突变导致的下游抑癌基因失活、癌基因激活有关，这些变化进而激活细胞癌变信号通路，增加CRC易感性。

淋巴结转移与CRC疾病进展及预后关系密切。Jiang等[16]研究发现，mir-34a/b/c基因敲除小鼠肿瘤负荷分级较未敲除鼠增加，且成纤维细胞生长因子受体1、受体酪氨酸激酶等淋巴结转移相关基因在肿瘤组织中高表达，小鼠生存期缩短。周联明等[17]研究证实CRC患者血清mir-34c表达水平与淋巴结转移、TNM分期和肿瘤直径负相关，在CRC

侵袭及转移过程中发挥重要作用。本研究分析结果显示，TC+CC基因型CRC患者预后状况差于TT型患者，TC、CC基因型是CRC预后不良的危险因素。

综上所述，mir-34b/c基因rs4938723多态性与河南汉族人群CRC遗传易感性关系密切，且TC、CC基因型患者预后不良风险较高。该结论为CRC的诊断及个体化治疗提供了参考依据，但mir-34b/c基因多态性对CRC发生发展及预后转归的影响机制仍需要进一步研究。