HPLC 法分别测定穿心莲茎、叶中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量

庄子瑜，于远洋，董斌

(大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连)

0 引言

穿心莲为爵床科植物Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees.的地上部分，有清热解毒、消肿止痛、凉血等作用，民间用作苦补健胃和抗菌消炎药。现代研究表明，穿心莲的主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯类化合物具有明显的药理活性，可用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，蛇虫咬伤[1]。中国药典2015年版(一部)穿心莲项下对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯进行了含量测定。本文参考文献，使用药典方法微调后[2，3]，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定穿心莲植株不同部位(叶、嫩茎、老茎)中两者的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2998 ACQUITY HPLC 系 统 (PDA 检测 器)，Empower 工作站(Waters 公司)；Diamonsil C18（2）（5μm，4.6×250mm）填料：十八烷基键合硅胶；Waters 公司)；Sartorius BP211D、Sartorius BP221S 电子天平(Sartorius 公司)。

1.2 试药

对照品穿心莲内酯（批号110797-201609 99.7%），脱水穿心莲内酯（批号110854-201710 99.4%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水。穿心莲药材(购自河北亳州药材市场，经大连市药检院中药室鉴定)。

2 色谱条件及系统适用性试验

采用Diamonsil C18（2）（5μm，4.6×250mm）色谱柱，以甲醇- 水（50:50）为流动相；检测波长: 穿心莲内酯225nm，脱水穿心莲内酯254nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃；进样量10μl。

3 溶液配制

3.1 对照品溶液

精密称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 各含0.1mg 的混合溶液，即得。

3.2 供试品溶液

取穿心莲药材，将嫩茎（绿色）、叶、老茎（非绿色）分类后，分别粉碎，过四号筛，分别精密称取各部位细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40% 甲醇25ml，称定重量，浸泡1h，超声处理（功率250W，频率33kHz）30min，放冷，再称定重量，用40%甲醇补足减失的重量。离心（转速为每分钟8000 转）10min，精密量上清液10ml，加在中性氧化铝柱（200-300 目，5g，内径为1.5cm）上，用甲醇30ml 洗脱，收集洗脱液，置50ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4 样品测定

按“3.2”项操作，得供试品溶液。精密吸取供试品溶液10L 注入色谱仪，按上述色谱条件进行测定，结果见表1。

表1 穿心莲不同部位含量

5 方法学验证

5.1 线性范围考察

取穿心莲内酯对照品10.39mg，分别制成62.15、41.44、20.72、10.36、5.18μg/ml 的溶液，取脱水穿心莲内酯对照品10.22mg，分别制成20.32、10.16、4.063、2.032、1.016μg/ml 的溶液，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表2。

表2 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯线性范围考察结果

以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y=2120019X-3466 r=0.9999（穿心莲内酯）和Y=1816518X-3294 r=0.9999（脱水穿心莲内酯）。

结果表明：穿心莲内酯在0.05179-0.6215μg 范围内线性关系良好；脱水穿心莲内酯在0.01016-0.2032μg 范围内线性关系良好[4]。

5.2 精密度

考察取同一供试品溶液连续进样6次，测得穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积的RSD分别为0.9%、0.9%。结果表明，仪器精密度良好[5]。

5.3 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16 和24h 进样测定。测得穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积的RSD分别为0.9%、0.9%。结果表明供试品溶液中上述2个成分在24h 内稳定性良好。

5.4 重复性考察

取同一批供试品，平行制备6 份供试品溶液，测定，记录各组分色谱峰面积。结果重复性符合要求。

5.5 加样回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批号的样品共9 份（各0.5g），取每三份为一组，每组分别精密加入含穿心莲内酯（0.5987mg/ml）及脱水穿心莲内酯（0.1495mg/ml）的混合对照品各1ml、2ml、3ml，再分别精密加入甲醇50ml，按上述条件操作，计算回收率。测定结果表明方法的准确度较好[6]。

5.6 定量限

测定取同一对照品溶液，用甲醇溶液逐级稀释，进样测定。取穿心莲对照品溶液（0.1657μg/ml），其信号约为噪音信号的10 倍，得检测限为0.1657μg/ml（即1.657×10-9g）；取脱水穿心莲对照品溶液（0.3250μg/ml），其信号约为噪音信号的10 倍，得检测限为0.7663μg/ml（即3.250×10-9g）。

5.7 检出限

测定取同一对照品溶液，用甲醇溶液逐级稀释，进样测定。取穿心莲对照品溶液（0.08287μg/ml），其信号约为噪音信号的3 倍，得检测限为0.08287μg/ml（即0.8287×10-9g）；取脱水穿心莲对照品溶液（0.1625μg/ml），其信号约为噪音信号的3 倍，得检测限为0.1625μg/ml（即1.625×10-9g）。

6 讨论

从穿心莲药材的测定结果来看，穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量叶中均明显高于茎；叶中穿心莲内酯含量约为嫩茎的4.1 倍，约为老茎的21.9 倍；叶中脱水穿心莲内酯含量约为嫩茎的3.3 倍，约为老茎的26.2 倍；所以药用穿心莲的采集使用应以叶多茎少时为佳[7,8]，鉴于安国、亳州药材市场已将穿心莲茎叶分开销售，建议药典委完善使用穿心莲药材的中成药处方，对穿心莲投料的茎叶比例作出相关规定。