不同精粗比底物下添加亚硝酸钾对长期瘤胃体外发酵的影响

林 淼， 张世杰， 葛红帆， 张 蒙， 巩 帅

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

亚硝酸盐是瘤胃硝酸盐还原的中间产物，目前对亚硝酸盐的关注多集中在过量亚硝酸盐导致机体中毒（Cockburn等，2013）。但是确定亚硝酸盐对瘤胃发酵的影响及其调控因素具有重要的价值。Asanuma等（2015）报道，硝酸盐易在瘤胃内被还原为亚硝酸盐进而生成氨。Wang等 （2018）研究表明，硝酸盐和亚硝酸盐可提高瘤胃微生物蛋白的合成量。但是，亚硝酸盐还原为氨比硝酸盐还原为亚硝酸盐需要更多的电子（Latham等，2016；Iwamoto 等，2001）。 Latham 等（2016）报道，氢（H+）是亚硝酸盐还原的必需电子供体，同时供氢体是日粮碳水化合物发酵的产物。丁健（2003）研究表明，日粮精粗比为8：2时，瘤胃微生物活性及发酵水平较高。同时，高精粗比改变了瘤胃体外发酵参数，显著提高了氨态氮的利用率（陈志龙等，2016；何玉鹏等，2014）。 林淼等（2014）报道，NDF:NFC=0.71时，最有利于湖羊瘤胃还原硝酸盐。Sakthivel等（2012）研究表明，高精粗比可促进硝酸盐的还原。由于饲喂亚硝酸盐存在中毒风险，体外培养就成为研究亚硝酸盐瘤胃发酵的主要手段。然而，关于瘤胃体外长期培养的发酵模式是否发生变化的研究较少。同时，不同精粗比对亚硝酸盐的体外瘤胃发酵的影响鲜见报道。因此，本试验选用玉米和苜蓿为发酵底物配合成不同精粗比，研究其对长期体外传代培养的亚硝酸盐还原的影响，为探索调控亚硝酸盐瘤胃还原提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计 采用双因素双水平试验设计，选取2头体况良好，安装永久性瘤胃瘘管的湖羊作为瘤胃液供体动物。动物的全混合日粮精粗比为6：4，饲粮组成为玉米20%，豆粕6%，玉米酒精糟7%，豆皮20%，燕麦草20%，大豆油1%，小苏打1%，预混料5%。饲粮粗蛋白质含量为14.12%，消化能为9.26 MJ/kg，中性洗涤纤维含量为30.14%。每天饲喂三次 （07:30、14:30和20:30），自由饮水。晨饲后5 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，经4层纱布过滤，迅速带回实验室进行体外培养。

1.2 体外发酵底物 将玉米和苜蓿粉碎过1 mm筛，分装，广口瓶贮存备用。发酵底物组成如下：

LC：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿；LC-N：0.07 g玉米+0.21 g苜蓿+亚硝酸钾 （终浓度10 mmol/L）；HC：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿；HC-N 底物：0.21 g玉米+0.07 g苜蓿+亚硝酸钾（终浓度10 mmol/L）。各设置3个平行。试验所用亚硝酸钾购自上海沪试。

1.3 体外培养方法 称取底物，分别转移入厌氧瓶，加入15 mL培养液和2 mL的瘤胃发酵液，持续通无氧CO2，密封后记录初始气压，并放入39℃恒温培养箱中培养24 h，视为一代。在培养24 h之后，取出厌氧瓶，记录末气压；开盖吸取2 mL培养液，传代入新鲜培养基中，密封记录下一代的初期气压，放入39℃恒温培养箱中培养24 h。整个接种和传代过程，必须保证厌氧。

每次传代前测定发酵液pH，并每培养30代采集一次样本，备测NO2-、NH3-N及TVFA浓度。30代结束后玉米苜蓿比例由1:3更换为3:1，即用底物HC替换底物LC，用底物HC-N替换底物LC-N，继续培养至第30代结束；测定指标同上。

1.4 样品的采集与分析 在培养的相应代次采集2 mL发酵液，置于-20℃保存备测。样本液解冻后离心（12000 r/min，20 min），保留上清液，按照1:5的比例加入25%的偏磷酸，冷冻过夜；再取出解冻后离心（12000 r/min，20 min）。 将此去蛋白后的上清液分成三份，分别用于测定NO2-、NH3-N和VFA的含量。NO2-浓度采用比色法（南京建成生物工程研究所试剂盒）；NH3-N浓度采用酚-次氯酸钠比色法（Broderick 等，1980）；VFA浓度采用日本岛津GC-14B气相色谱仪测定 （林淼等，2010）。

1.5 统计分析 产气量按以下公式计算：

V x=Vj×Ppsi×0.068004084；

式中：Vx为39℃时的产气量，mL；Vj为发酵瓶内气体的体积，mL；Ppsi为一定时刻发酵瓶内的气压，psi。

试验数据采用SAS 9.2统计软件中的MIXED进行方差分析，以Tukey做两两比较，结果以“平均值”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 长期培养的体外发酵产气量和pH变化规律 不同玉米：苜蓿比例各培养30代的产气量和发酵液pH见图1。在培养30代后，两个精粗比的体外产气量和pH均达到稳定，且标准误减少。添加亚硝酸钾降低了发酵产气量，升高了发酵液pH。

2.2 不同精粗比条件下添加亚硝酸钾对发酵参数的影响 由表1可知，LC-N组产气量显著低于LC组和LC-N组（P＜0.01），LC组和HC组体外产气量无显著差异；亚硝酸钾和玉米苜蓿比例间存在交互作用。发酵液pH的变化规律为LC-N组＞LC组＞HC组＞HC-N组（P＜0.01）。各组发酵液NO2-浓度均无显著差异（P＞0.05）。发酵液NH3-N浓度变化规律为LC-N组＞HC-N组＞LC组＞HC组（P＜0.01）；亚硝酸钾和玉米苜蓿比例间存在交互作用。发酵液TVFA产量以LC组和HC组最高，HC-N组次之，LC-N最低（P＜0.01）。此外，LC组的乙酸比例显著高于其他各组，而丙酸比例显著低于其他各组（P＜0.01）；丁酸比例各组间无显著差异（P＞0.05）。

表1 不同玉米∶苜蓿比例下添加亚硝酸钾对体外发酵参数的影响

3 讨论

3.1 长期培养的体外发酵产气量和pH变化规律 Martinez等（2010）报道，与饲喂相同饲料的瘤胃液供体羊相比，体外发酵16 d后，自动核糖体基因间隔分析（ARISA）结果表明，未检测到特异性细菌群落的变化；而Zapletalova等（2016）证明了利用双外流连续培养技术，在接种瘤胃内容物10 d内，发酵液SCFA产量和pH与瘤胃内相似，但瘤胃细菌群落结构发生了变化，并且此变化归因于该生物反应器中氧化还原电位的下降。出现不同结果的原因可能是选用了不同的发酵底物和培养模式。本试验以玉米和苜蓿为发酵底物，采用每日传代的方式实现30 d的连续培养，通过检测产气量和发酵液pH发现，体外产气量和pH在传代至20代之后趋于稳定，说明本试验培养30代时的数据较合理，可用于发酵参数的比较分析。

3.2 不同精粗比条件下添加亚硝酸钾对发酵参数的影响 日粮精粗比对瘤胃内环境、瘤胃发酵水平和微生物活性及区系都有一定的影响。本试验主要对发酵液的产气量、pH及NO2-、NH3-N、VFA浓度五个指标进行了测定和比较。目前对亚硝酸盐的研究多集中在病理学方面，鲜有关于直接添加亚硝酸盐对瘤胃发酵影响的报道。不同精粗比条件下发酵液中的NO2-24 h浓度无显著变化，说明精粗比不影响亚硝酸盐的体外还原。Lin等（2013）体外选用 2：8 和 8：2 的精粗比，添加硝酸盐后发现体外产气量显著降低，这与本试验精粗比为1：3的产气量规律相同。但本试验随着玉米比例的升高，亚硝酸钾对体外产气量无显著影响，该结果与前人研究结果不同。

无论是否添加亚硝酸钾，本试验精粗比为1：3的pH显著高于精粗比为3：1，这与杨靖等（2019）研究结果一致。本试验中精粗比为1：3底物添加亚硝酸钾显著提高了发酵液pH，这与前人研究结果一致。Zhao等（2015）选用精粗比为3：7的肉牛日粮中添加硝酸盐发现瘤胃pH升高。陈志远等（2016）选用精粗比为6：4的日粮研究湖羊日粮中添加硝酸盐后瘤胃发酵的变化，结果表明pH显著升高。Wang等（2018）在精粗比为5：5的奶牛日粮中添加硝酸盐发现瘤胃pH显著升高。相反的是，本试验发现精粗比3：1底物添加亚硝酸钾显著降低了发酵液pH，该结果与前人研究结果不同。

本试验添加亚硝酸钾显著提高发酵液的NH3-N含量，这与前人研究结果一致（陈志远等，2016；Zhao 等，2015；Lin 等，2013），表明亚硝酸钾可作为瘤胃细菌有效的非蛋白氮来源。而无论是否添加亚硝酸钾，NH3-N含量随玉米比例的升高而下降。有研究表明，山羊日粮精粗比为8：2时，细菌15N的富集量最高（赵国琦等，2004）。类似的研究在犊牛上表明，精粗比为6：4的日粮氨态氮浓度显著高于精粗比为5：5时 （邹新平等，2015）。推测快速发酵碳水化合物含量高时，可提高氨态氮的利用效率。

本试验中，当精粗比由1:3提高为3:1后，乙酸含量下降，丙酸含量升高。梁静等（2016）的体外培养结果选用了精粗比为 3：7、4：6、5：5、6：4 和7：3，得出与本试验相似的结果。当日粮中精料比例增加时，乙酸浓度显著降低，丙酸浓度显著升高（Zhao等，2015）。高精料日粮中可发酵碳水化合物含量较多时，丙酸产量提高，发生的是丙酸发酵（丁健，2003）。因此，试验中当增加了玉米用量后，丙酸产量随之上升。当精粗比1∶3时添加亚硝酸钾TVFA产量显著降低，乙酸比例降低，丙酸比例升高；但选用发酵底物精粗比3∶1时，添加亚硝酸钾不改变体外产气量、TVFA产量、乙酸和丙酸比例，这说明亚硝酸钾改变了瘤胃发酵类型。

4 结论

在本试验条件下，提高底物精粗比，降低了发酵液pH、氨态氮和总挥发性脂肪酸的浓度以及乙酸的比例，但升高了丙酸的比例；与高精粗比底物相比，在低精粗比底物中添加10 mmol/L亚硝酸钾显著降低了产气量和总挥发性脂肪酸产量，提高了发酵液pH、氨态氮浓度；高精粗比更适合于亚硝酸盐的瘤胃发酵。