硝酸镧对急性肝损伤小鼠的保护作用研究

李睿珺， 周雅琳， 刘 伟， 李 雍， 秦 勇， 于兰兰， 陈宇涵， 许雅君，2*

（1.北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京100191；2.食品安全毒理学研究与评价北京市重点试验室，北京 100191）

肝脏是乙醇代谢的主要器官，也是乙醇毒性的主要靶点。在肝脏中，乙醇被代谢成有毒的代谢产物乙醛，乙醛与细胞大分子（脂质和蛋白质）相互作用，激活促炎转录因子，诱导炎症介质的表达，从而引起肝损伤（Jaruga等，2004）。由乙醇引起的细胞内活性氧（ROS）过量产生且不能被及时清除的氧化应激是酒精性肝病的发病机制之一（Li等，2018；李大伟等，2014；Xu 等，2014；Jin 等，2013）。 研究表明，乙醇能降低SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和GSH含量，因此，提高抗氧化能力可有效保护肝细胞免受乙醇的损伤（Sid等，2013）。氧化应激还可以引起脂质过氧化，形成具有肝毒性的MDA（Ayala等，2014）。除了ROS导致的氧化应激，乙醛诱导的炎性细胞因子也可导致过氧化产物的生成，从而引起肝脏损伤（Zhou等，2017）。

稀土元素是17种有相似原子结构和离子半径的特殊元素的统称，分为轻稀土和重稀土两类。已有研究表明，稀土元素具有抗氧化的作用。申秀英等（2004）研究表明，低剂量钐在一定范围内能提高SOD的活力，增强机体的抗氧化能力，对脂质过氧化反应有一定的抑制作用。夏青等（2008）研究指出，低浓度的铈离子可减少脂质过氧化损伤。李树蕾等（2001）研究表明，0.1 mg/kg和2.0 mg/kg的硝酸稀土可增强胃黏膜的抗氧化能力，并抑制脂质过氧化进程。屈艾等（2005）研究指出，钬元素在一定的剂量范围内有抗氧化损伤的作用，能增强抗氧化酶的活性。王春霞等（2000）研究表明，硝酸稀土镧、镨、钕、钐、镱、钇能抑制超氧阴离子并存在剂量反应关系。作为广泛使用的轻稀土元素，镧是稀土元素中最具反应性的一种（Zheng等，2013），其分子结构和离子半径与钙离子非常相似，化学性质活泼，被称为超级钙，并因其毒性较低被广泛用于农业和医学研究。

关于硝酸镧改善乙醇所致的急性肝损伤鲜有报道，已有的试验也缺乏对硝酸镧保护作用的最优效应剂量的研究。故本试验以硝酸镧为研究对象，给小鼠连续灌胃30 d后，建立急性肝损伤模型，观察不同剂量下硝酸镧对小鼠血清ALT和AST，血清和肝脏T-SOD、GSH、MDA的影响，为探究硝酸镧对乙醇所致的急性肝损伤小鼠的保护作用及最佳作用剂量提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 硝酸镧 （纯度≥99.99%，CAS：10277-43-7，美国 Sigma公司）。谷丙转氨酶（ALT）测试盒 （C009-2-1）、谷草转氨酶 （AST）测试盒（C010-2-1）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（A001-3）、谷胱甘肽（GSH）测试盒（A006-2）、丙二醛 （MDA）测试盒 （A003-1）、蛋白定量测试盒（A045-2），均购自南京建成生物工程研究所。

电子天平（SPN3001F，美国奥豪斯），电热恒温水浴锅（HH·S11-1，北京长安科学仪器厂），全自动多功能酶标仪 （MULTISKAN MK3，美国Thermo），低温自动平衡离心机（BFX5-320，白洋离心机厂），紫外分光光度计（UV-2000，美国UNIC），高速匀浆机（T18，德国 IKA 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物及饲养条件 健康SPF级雄性ICR 小鼠 84 只，体重（33.0±3.0）g，由北京大学医学部试验动物中心提供[SCXX（京）2016-0010]。动物饲养在屏障环境，温度控制在（23±2）℃，相对湿度为50%～60%，昼夜照明时间为12 h:12 h。

1.2.2 试验分组及模型建立 试验动物适应性喂养5 d后，称量其体重作为初始体重，并按体重随机分为空白组，模型组及硝酸镧A、B、C、D和E组 （称取相应质量的硝酸镧加入蒸馏水中配制而成），每组各12只。硝酸镧A到E组分别给予相应剂量的硝酸镧溶液灌胃，空白组和模型组经口灌胃蒸馏水，灌胃体积为0.1 mL/10 g，连续灌胃30 d，各组均给予维持饲料，灌胃期间自由进食和饮水。末次灌胃后，模型组和5个硝酸镧干预组隔夜禁食 （16 h），然后一次性给予50%的乙醇12 mL/kg灌胃，6 h后杀鼠取材并检测各项指标。试验分组及受试样品给予见表1。

表1试验分组及受试样品给予

1.2.3 测试样品的制备 乙醇灌胃6 h后，试验动物摘眼球取血并断颈处死，留取血液和肝脏组织。将血液静置1 h后，3000 r/min离心10 min，留取上清液备用。摘取的肝脏组织先在预冷的0.9%生理盐水里漂洗并用滤纸吸干其表面水分，称取小部分肝组织并加入其9倍体积的生理盐水，在冰水浴中用组织匀浆机制备肝脏匀浆，3000 r/min离心10 min，留取上清液备用。

1.2.4 指标检测

1.2.4.1 体重、食物利用率、肝脏质量和肝脏系数适应性喂养5 d后，对小鼠称重，记为初始体重并根据体重随机分组，每隔7 d在同一时间称量小鼠体重和食物消耗量，并根据小鼠体重增量（g）和食物消耗量（100 g）计算食物利用率。称量小鼠肝脏质量，并根据肝脏质量（g）和小鼠处死前体重（g）计算肝脏系数。

1.2.4.2 血清和肝脏组织检测 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测血清和肝组织的相应指标：血清ALT和AST、血清和肝脏T-SOD、GSH、MDA及肝组织蛋白含量。按照试剂盒的操作步骤对上述指标进行测定。采用微板法测定ALT和AST的活力。采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定T-SOD活力。采用比色法测定GSH含量，原理为二硫代硝基苯甲酸与硫基化合物反应时能产生一种黄色化合物，其吸光度反映了GSH的含量。用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA的含量。每个样品重复测量三次并计算平均值。

1.3 统计分析 试验结果均为连续变量，以“平均数±标准差”表示。所有数据均用SPSS20.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析 （one-way ANOVA）比较组间差异，以P＜0.05为有统计学差异的判断标准。方差齐时，用SNK法进行两两比较；方差不齐时，用Tamhane’s法进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 体重和食物利用率 由表2和图1可知，各组小鼠体重随试验时间的延长而增加，各组小鼠的体重和食物利用率均无显著差异（P＞0.05），试验期间，动物状态良好，无异常表现，表明硝酸镧在本试验剂量范围内对小鼠的生长发育无不良影响。

表2硝酸镧对小鼠体重的影响 g

2.2 肝脏质量和肝脏系数 如表3所示，与空白组相比，模型组肝脏质量和肝脏系数显著增加（P＜0.01），说明乙醇会导致小鼠肝脏受损，组织肿胀。与模型组相比，硝酸镧各剂量组肝脏质量均有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，硝酸镧各剂量组小鼠肝脏系数均有不同程度的降低，其中硝酸镧E组显著降低（P＜0.05），降低0.67%，说明一定剂量的硝酸镧能有效抑制乙醇所致的肝脏肿大。

表3 硝酸镧对小鼠肝脏质量和肝脏系数的影响

2.3 硝酸镧对小鼠血清ALT和AST的影响 如表4所示，模型组小鼠血清中ALT和AST含量明显增加，与空白组相比差异极显著（P＜0.01），表明乙醇所致小鼠肝损伤模型建立成功。经硝酸镧干预后，各组小鼠ALT相比模型组均有不同程度的改善，其中以硝酸镧C、E组的效果最好 （P＜0.05 或P＜ 0.01），分别降低 23.58、21.07 U/L，各组小鼠AST相比模型组均有不同程度的改善，其中以硝酸镧C、D、E组的效果最好 （P＜0.05或P＜0.01），分别降低 52.56、43.83、28.54 U/L，表明硝酸镧能显著改善乙醇所致急性肝损伤小鼠的肝功能。

表4 硝酸镧对小鼠血清ALT和AST的影响U/L

2.4 硝酸镧对小鼠T-SOD活力的影响 如表5所示，与空白组相比，模型组血清和肝脏中TSOD活力极显著降低（P＜0.01），提示乙醇能降低小鼠体内抗氧化酶的活性。与模型组相比，随着硝酸镧剂量的增加，各干预组T-SOD活力逐渐增强，其中硝酸镧B、C、D、E组血清中T-SOD活力极显著增强（P＜ 0.01），分别增加 27.53、38.74、48.01、53.96 U/mL， 硝酸镧 C、D、E 组肝脏中 TSOD活力显著增强（P＜0.05或P＜0.01），分别增加 15.87、18.6、17.78 U/mg prot。

表5 硝酸镧对小鼠T-SOD活力的影响

2.5 硝酸镧对小鼠GSH含量的影响 如表6所示，与空白组相比，模型组血清GSH含量极显著降低（P＜0.01），肝脏GSH含量有所降低，但差异不显著（P＞0.05），提示乙醇能降低小鼠体内抗氧化物质的含量。与模型组相比，随着硝酸镧剂量的增加，各干预组血清GSH含量逐渐升高，且在D、E组中表现出统计学差异（P＜0.05或P＜ 0.01），分别增加 5.94、7.86 μmol/L。 肝脏中GSH含量呈现出和血清GSH含量相似的变化趋势，且在硝酸镧E组中显著升高 （P＜0.05），增加 0.83 μmol/g prot。

表6 硝酸镧对小鼠GSH含量的影响

2.6 硝酸镧对小鼠MDA含量的影响 如表7所示，与空白组相比，模型组血清和肝脏中MDA含量显著增加（P＜0.05），提示乙醇能增加小鼠体内脂质过氧化物的含量。与模型组相比，多数硝酸镧干预组的血清MDA含量表现出下降趋势，且在D、E组中表现出统计学差异（P＜0.01），分别降低4.13、4.41 nmol/mL。与模型组相比，随着硝酸镧剂量的增加，各干预组肝脏MDA含量逐渐降低，其中硝酸镧E组MDA含量显著降低（P＜0.05），降低 0.64 nmol/mg prot。

表7 硝酸镧对小鼠MDA含量的影响

3 讨论

ROS是机体正常代谢过程的产物，线粒体是其重要来源，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基以及一氧化氮等 （Afonso等，2019）。适量的ROS为人体生命活动和组织细胞生长代谢所必需，但过量的ROS会损伤抗氧化系统，导致脂质过氧化，并降低GSH和SOD；还能导致DNA损伤和线粒体功能障碍（Wang等，2019）。这些改变最终会导致组织损伤和细胞凋亡，损伤可发生在各种脏器，如肝、肾、肺等（Xin 等，2019）。 细胞内超量的过氧化物会引起内质网应激，最终导致蛋白质翻译后修饰异常。乙醇介导的氧化应激已被证实与酒精性肝病、中枢神经系统异常、酒精性胃病和发育障碍等密切相关，其分子机制可能与刺激线粒体产生更多的超氧阴离子和过氧化氢，导致肝细胞脂质过氧化有关（左玮等，2018；Altamirano等，2011）。乙醇也可诱导红细胞产生氧化应激，在与多不饱和脂肪酸的共同作用下，乙醇在代谢过程中产生的过量自由基会进一步增加，这些超氧基团可能通过血液循环损伤其他器官或组织 （王荣荣等，2019）。

ALT和AST是评价肝脏是否受损的两个重要的生化指标。正常情况下，ALT和AST在血清中的含量较低，而当肝脏受损时，大量ALT和AST释放入血，引起血清中这两种酶活性明显升高，表明肝脏中细胞渗漏和细胞膜功能完整性丧失 （Fujiwara等，2013；Neuman 等，2013；Zeng 等，2013；Yan 等，2007；Lin 等，2004）， 其在血液中的水平也是临床检验肝功能的重要指标之一。本研究中，模型组小鼠血清中ALT和AST活性显著升高，表明乙醇能造成小鼠的急性肝损伤。与模型组相比，部分硝酸镧干预组小鼠血清ALT和AST显著降低，表明硝酸镧具有一定的护肝作用。

SOD能阻止自由基启动脂质过氧化进程，是ROS清除过程中发挥作用的第一种抗氧化酶，能保护细胞免受氧化损伤，其活力反映了机体清除氧自由基的能力，在清除过氧化氢、超氧阴离子和羟自由基中发挥关键作用（石敏娟等，2019；Wang等，2019）。本研究中，与模型组相比，随着硝酸镧剂量的增加，各干预组小鼠的T-SOD活力逐渐升高，并在大部分干预组的血清和肝脏中表现出显著差异，提示硝酸镧能通过增强小鼠体内抗氧化酶的活性而发挥护肝作用。

GSH是重要的低分子巯基抗氧化剂，在生物系统中主要以还原形式存在，也是GPX和谷胱甘肽S-转移酶（GST）的重要辅因子，其功能的发挥取决于半胱氨酰残基的硫醇基数量，与多种外源性和内源性氧化剂的解毒有关，在氧化应激中起保护作用（Adriana 等，2020；Farina 等，2019）。 本研究中，与模型组相比，随着硝酸镧剂量的增加，各干预组小鼠血清和肝脏GSH含量逐渐升高，并在硝酸镧D、E组中表现出统计学差异，表示硝酸镧可通过增加小鼠体内抗氧化物质的含量而减轻肝损伤。

MDA是不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应生成的终末产物之一，其含量可以间接反映膜脂质氧化的受损程度 （王艳婕等，2019；Gao等，2017）。也有研究表明，ROS和MDA存在剂量反应关系（Chen等，2019）。MDA是肝脏脂质过氧化的生物标志物（Li等，2015），是间接评价保肝药物疗效的生化指标 （Sreelatha等，2009）。本研究中，与模型组相比，多数硝酸镧干预组的血清和肝脏MDA出现下降，且在部分硝酸镧干预组中表现出统计学差异，表示硝酸镧可通过减少脂质氧化终产物的含量而发挥对急性肝损伤小鼠的保护作用。

黄可欣（2003）和李冬梅（2008）等的研究表明，低剂量硝酸镧能适当提高机体的抗氧化能力，并认为稀土的生物学效应与剂量大小有关，小剂量有刺激作用而大剂量则有抑制作用。刘颖等（2001）研究指出，一定剂量的硝酸镧可以升高SOD和GPX，降低MDA含量。本研究结果表明，硝酸镧能提高乙醇所致急性肝损伤小鼠的抗氧化能力，对小鼠肝脏存在一定的保护作用，这与以往的研究结果一致。

4 小结

本试验结果表明，硝酸镧能通过降低小鼠血清ALT和AST的活性，提高其体内抗氧化酶的活性，清除体内自由基和降低氧化应激产物含量而发挥保护肝细胞的作用并恢复肝功能，本试验条件下，最佳保护作用剂量为1.0 mg/kg和2.0 mg/kg。