丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马、杏仁核H2S/CBS通路及学习记忆能力的影响*

姚良雪， 韩家鑫， 魏培韵， 侯思博， 何潇剑， 张瑞岭,2△， 杜爱林,2△

(1. 新乡医学院生理学与神经生物学教研室， 中英脑功能损伤联合实验室， 河南省高校脑研究重点实验室培育基地 河南 新乡 453003； 2. 新乡医学院第二附属医院， 河南省生物精神病学重点实验室， 河南 新乡 453003)

酒精中毒在全球影响健康危险因素中处于前列，在我国的发病率也逐年上升。慢性酒精中毒可以导致神经损伤[1]，酒精能高效穿过血脑屏障影响与记忆相关脑区及其功能[2,3]，导致记忆减退、认知障碍等表现。慢性酒精中毒能促进硫化氢(H2S)的产生。生理浓度的H2S能发挥多种神经调节功能，并有线粒体保护作用，但H2S浓度异常升高引起细胞损伤[4,5]。在中枢神经系统中，内源性H2S的主要催化调节酶是胱硫醚-β-合成酶(N-cyclohexylbenzothiazole-2-sulphenamide, CBS)，并且具有组织特异性。酒精中毒可使海马等部位CBS活性增强，H2S水平异常升高引起神经系统损伤[6]。丁苯酞(N-butylphthalide, NBP)是我国自主研发的新药物，具有多种神经保护作用，能改善线粒体功能，减轻记忆障碍，对脑缺血等脑损伤的多个环节均有作用。丁苯酞可能降低了酒精中毒所致高浓度H2S，从而能够对慢性酒精中毒起一定的改善作用。

本研究通过复制大鼠慢性酒精中毒模型并观察丁苯酞作用于慢性酒精中毒大鼠后海马及杏仁核内H2S和CBS的含量、线粒体ATP酶活性以及大鼠学习记忆能力的变化，探究丁苯酞对慢性酒精中毒造模大鼠与学习记忆相关的杏仁核及海马组织的积极影响，以了解NBP对慢性酒精中毒导致学习记忆能力减退的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

取清洁级健康SD雄大鼠90只，3～4周 (来自新乡医学院动物中心),体重(140±20)g。在22～25℃实验室中对大鼠进行4～6 d的适应期饲养，然后将大鼠随机分成3组：正常对照组(normal control group，NC组)、丁苯酞治疗组(Butylphthalide remedy group，BR组)、慢性酒精中毒模型组(Model group, M组)，每组30只。

1.2 主要仪器和试剂

超低温冰箱由美国Thermo Forma公司生产；Morris水迷宫和行为学记录软件EthoVision XT 8购于德国Noldus公司；购自德国Eppendorf公司的微量加样器；高速冷冻离心机(产自德国Heraeus公司)；Bio-TekELx800全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司)；FA1004电子分析天平由上海泸奥明科学仪器有限公司提供；DAB显色试剂盒、链霉卵白素工作液、山羊抗兔IgG聚合物、封闭用正常山羊血清工作液由北京中杉金桥生物技术有限公司生产；线粒体提取试剂盒、超微量总ATP酶测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒(购于中国南京建成生物工程研究所)；丁苯酞由石药集团恩必普药业有限公司提供；其他试剂均为国产或进口分析纯级。

1.3 模型制作和处理

除正常对照组外，把其余组均复制成慢性酒精中毒动物模型。造模期间控制室温23 ～25℃，每日9：00重新配制体积分数为6% 的酒精水溶液(大鼠自由饮水的唯一来源)并置换。14 d后，按5 mg/kg的比例将丁苯酞溶解在1 ml生理盐水中，丁苯酞治疗组每日腹腔注射一次，连续14 d。其余两组每日腹腔注射1 ml生理盐水。

1.4 学习记忆能力评价

用Morris水迷宫(型号: RD1101-MWM-G)测试各组大鼠。实验前剔除游泳能力极差的大鼠。在未被剔除大鼠中每组随机选24只进行水迷宫实验。定位航行实验共5 d，训练4 d，第5日进行检测大鼠对自身形成的空间位置能力记忆的保持程度。训练时控制水下平台在水下0.5 cm处，水温22℃±2℃，所有大鼠每天每象限各训练1次，每次训练60 s。训练期内用追踪记录大鼠游动轨迹。若60 s内大鼠找到水下平台，让其在平台上停留30 s,来巩固其空间记忆。如60 s内未找到平台，通过引导同样使其在平台上停留30 s。第5日进行空间记忆探索检测，移除水下平台,将大鼠在原平台所在象限的对侧释放,规定300 s游泳时长,期间记录大鼠在原平台所在象限跨越平台的次数和游泳距离并计算两者比重。

1.5 亚甲基蓝分光光度法测定海马、杏仁核中H2S的含量

水迷宫实验结束后，每组随机选取8只大鼠进行免疫组化实验，大鼠行腹腔麻醉，断头取脑，取出新鲜海马及杏仁核组织，-80℃冰箱保存， -20℃下充分研磨。采用亚甲基蓝分光光度法[7]，波长670 nm处测定大鼠海马以及杏仁核组织液的吸光度，按照H2S标准曲线计算相应H2S含量。将杏仁核海马中硫化氢的含量表示为nmol/g。

1.6 免疫组化观察海马、杏仁核CBS表达

再次随机选取8只大鼠进行免疫组化实验，对各组实验大鼠取脑，实施石蜡包埋常规切片处理，经脱蜡和水化以及抗原修复，免疫组化后，经暗处DAB显色，常规脱水、透明及中性树胶封片后，于显微镜下观察双侧海马、杏仁核并摄片,用image-pro-plus 6.0图像分析软件分析CBS的阳性表达情况。

1.7 线粒体的提取分离及ATP 酶活力的测定

剩余8只大鼠进行线粒体ATP酶活性测定，低温快速取出脑海马及杏仁核保存，严格遵循试剂盒说明书，提取组织经机械破裂、差速离心获得线粒体，经酶促及定磷反应处理，在636 nm波长处使用分光光度计测定吸光度值，依照相关公式来算出线粒体ATP酶活性。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 丁苯酞对各组大鼠学习记忆能力的影响

如表1、2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠学习与记忆的能力明显下降，表现为潜伏期和游泳距离的增多，第1至4日有极显著性差异(P< 0.01)；给予NBP处理后，相比模型组，治疗组大鼠潜伏期和游泳距离明显减少，第2至4日有极显著性差异(P<0.01)。

Tab. 1 Latency period of rats in each group in place navigation test(s， n= 8)

Tab. 2 Swimming distance of rats in each group in place navigation test(cm， n=8)

2.2 丁苯酞对各组大鼠海马、杏仁核组织中H2S的含量变化的影响

如表3所示，模型组大鼠与正常对照组相比，模型组海马、杏仁核组织内的H2S含量明显增高，有极显著性差异(P<0.01)；和模型组比较，NBP干预组大鼠海马、杏仁核组织中H2S含量均降低，有极显著性差异(P<0.01)。

Tab. 3 Mean content of H2S in hippocampus and amygdala tissue of rats in each group(nmol /g， n=8)

2.3 丁苯酞对各组大鼠海马、杏仁核组织中CBS表达的影响

如图1、图2所示，光镜下各组大鼠海马、杏仁核均可见一定量CBS阳性表达。如表4所示，各组大鼠海马、杏仁核均可见一定量CBS表达。与正常组相比，模型组CBS含量明显升高，有极显著性差异(P<0.01)；和模型组大鼠相比，NBP治疗干预组CBS含量降低，有极显著性差异(P<0.01)。

Tab. 4 Mean average optical density of CBS in hippocampal and amygdala tissue of rats in each group (OD， n=8)

2.4 丁苯酞对各组大鼠海马、杏仁核线粒体ATP酶活性的影响

如表5所示，和对照组相比，模型组大鼠海马组织、杏仁核线粒体ATP酶活性明显降低，有极显著性差异(P<0.01)；和模型组大鼠相比，治疗组大鼠给予NBP处理后，海马组织、杏仁核线粒体ATP酶活性上升，有极显著性差异(P<0.01)。

Fig. 1 Hippocampus of rats (× 400)

Fig. 2 Amygdala of rats (× 400)

Tab. 5 Mitochondrial ATPase activity in hippocampus and amygdala tissue of rats in each group(μmolPi/mg prot·hour， n=8)

3 讨论

慢性酒精中毒在全球不同程度地危害着人类健康。慢性酒精中毒可以引起神经系统损害，导致学习记忆能力下降以及精神行为功能的缺陷。在我国，慢性酒精中毒已成为不可忽视的社会公共卫生问题。

海马、杏仁核同属边缘系统，两者互相调节，功能联系密切[8]，是学习记忆经典神经环路的重要组成部分[9,10]，共同参与包括情感发生和学习记忆保存在内的多种过程[11]。海马对记忆信息进行中枢整合，是学习记忆、认知调节等功能的关键脑区[12]。 杏仁核可调节情感学习及记忆能力[13.14]，在情绪调控及记忆中的作用不可或缺。

Morris水迷宫用来研究空间学习记忆相关脑区功能[15,16]。本实验将大鼠暴露在水迷宫中，通过测定游泳距离、潜伏期等指标，测试空白大鼠、酒精中毒大鼠和NBP治疗干预组大鼠空间探索记忆能力[17]。结果显示，酒精中毒大鼠较对照组游泳距离和潜伏期延长，丁苯酞干预组在Morris水迷宫中的表现均改善。提示丁苯酞对大鼠的学习记忆能力减退有干预作用。

H2S是中枢神经系统中重要的信号分子，起神经保护作用[18,19]，胱硫醚-β-合酶(CBS)是神经系统H2S合成中的关键限速酶，该酶在神经系统特别是海马和杏仁核区中大量表达。CBS/H2S体系的维持与海马相关学习记忆能力有显著相关性[4]。

外源性H2S可增强海马、杏仁核内N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)依赖性的LTP,调节海马依赖的场景型记忆和新物认知能力，并抑制记忆的遗忘[20,21]。线索恐惧训练后大鼠脑组织的H2S含量增加，但过高水平的H2S对神经元有毒害作用，H2S发挥作用可因位置及含量不同而不同[22]。慢性酒精中毒可通过Ca2+超载引起钙调素活性提高以及激活NMDAR等途径激活CBS导致H2S合成过量，产生神经毒性作用[23，24]。丁苯酞可以抑制CBS活性，减少H2S的生成[6]。实验测得慢性酒精中毒大鼠大脑海马、杏仁核CBS的表达以及H2S的生成都明显高于对照组，而丁苯酞组水平可见明显改善。

线粒体是细胞内氧化磷酸化以及合成ATP的主要场所。ATP酶催化合成ATP,在能量代谢方面十分重要。高浓度H2S可通过抑制细胞色素C氧化以及引起线粒体钙超载造成线粒体能量代谢障碍，进而导致细胞损伤。本实验通过测定大鼠海马、杏仁核线粒体 ATP 酶活性发现，模型组大鼠海马、杏仁核内的线粒体ATP酶活性较正常组偏低，丁苯酞治疗组ATP酶活性较模型组有所提高，表明丁苯酞可有效改善慢性酒精中毒大鼠海马、杏仁核组织内线粒体的能量代谢障碍程度。

综上所述，丁苯酞减轻慢性酒精中毒对大鼠海马、杏仁核相关脑区结构功能的损害，可能是通过抑制因慢性酒精中毒引起的H2S/CBS系统的过度表达，改善能量供应和信息传递能力，提高慢性酒精中毒大鼠的学习记忆水平。