α-烯醇化酶基因干扰表达对籽鹅卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响*

计 红， 邵子益， 薛琳琳， 牛春阳， 詹雪龙， 杨 闯， 甄 莉， 杨焕民， 李士泽△

(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 黑龙江 大庆 163319， 2. 黑龙江职业学院， 黑龙江 双城 1501113)

α-烯醇化酶(α-enolase, ENO1)属于烯醇化酶家族，目前在多数组织中都可检测到ENO1的表达。资料显示，ENO1是一种多功能蛋白，研究最多的是ENO1在癌症发生发展中的作用及机制。在神经胶质瘤，神经母细胞瘤和其他类型的癌症细胞都检测到其表达[1]，提示癌症的发生均与ENO1有密切关系。Song等发现ENO1作为一种潜在的癌症预后标志物，可促进细胞生长，迁移和侵袭[2]。作为肿瘤细胞表面的纤维蛋白溶解酶原受体，ENO1可诱导细胞外基质降解，肿瘤发生和癌症细胞侵袭[3]。ENO1与机体免疫反应也有密切关系。Ray研究显示，用ENO1抑制剂可激活多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞样树突状细胞，并增加其诱导的特异性CD8+ CTL和NK细胞抗自体肿瘤细胞的活性，提示ENO1在该疾病免疫系统中具有重要作用[4]。Li等发现ENO1的自身抗体含量可作为骨肉瘤免疫诊断的潜在生物标志物，提示其可在免疫反应中发挥作用[5]。ENO1与角膜上皮细胞的增殖相关[6]。ENO1还可与热休克蛋白的功能相似，可以结合细胞骨架和染色质结构，提示其可能在细胞的转录和各种病理生理过程中具有重要作用[7]。此外，ENO1基因的编码产物也是值得深入研究的领域，如白色念珠菌ENO1基因编码转谷氨酰胺酶，参与生长，细胞分裂，形态发生和渗透保护[8]。

卵泡是动物机体生长最快的正常组织，禽类卵泡细胞与肿瘤细胞的增殖都非常迅速，而细胞的增殖需要大量的能量。肿瘤细胞可通过糖的无氧酵解来获取能量，Capello等证实ENO1是调控肿瘤代谢，促进肿瘤Warburg效应的主要调节分子[9]。东北籽鹅是东北地区传统优势鹅种，对其产蛋性能的研究具有重要价值。本课题组在前期实验发现，ENO1可能与籽鹅卵泡生长发育和卵泡选择存在密切关系[10]。因此，本研究采用原代培养产蛋期籽鹅卵泡颗粒细胞，通过转染发夹RNA(shRNA)干扰表达ENO1基因的方式，分析其对籽鹅卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响，探讨ENO1在禽类生殖生理中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；细胞周期检测试剂盒(美国BD Biosciences公司)；RNA提取及荧光定量PCR相关试剂(宝生物工程大连有限公司)；Solarbio血清(索莱宝公司)；M199培养液(美国Hyclone 公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；GPU6/GFP/Neo载体(上海吉玛基因股份有限公司)。

1.2 实验材料、分组与处理

从黑龙江省大庆市大同区北方种鹅场购买的8月龄产蛋期籽鹅，处死后取F1级卵泡，分离卵泡颗粒层细胞，加入含10%胎牛血清的M199培养液进行培养[11]。籽鹅卵泡颗粒细胞原代培养72 h换液，24 h后进行转染实验。本实验分为4组：ENO1干扰表达组(RNAi)、无关序列干扰组(NC)、培养液组(Control)、转染试剂组(Lip)。每组各设3个重复(n=3)。ENO1干扰表达组即将ENO1干扰表达重组质粒转染至卵泡颗粒细胞组；无关序列干扰组即将无关序列干扰表达重组质粒转染至卵泡颗粒细胞组；培养液组即正常细胞对照组；转染试剂组即只添加转染试剂的颗粒细胞组。ENO1干扰表达重组质粒在前期实验中已构建完成。每孔(12孔板)干扰质粒和Lipofectamine 2000转染剂量为4 μl和6 μl。转染48 h后收集细胞待用。表达量检测引物为：F: GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT；R: GTGGTGCAAGAGGCAT TGCTGAC。内参基因为GAPDH，引物为：F: GCTGATGCTCCCATGTTC GTGAT；R: GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC。

1.3 各组籽鹅卵泡颗粒细胞生长曲线的测定

通过WST-1(水溶性四唑盐试剂)法测定各组颗粒细胞数，在450 nm波长下检测吸光值。

1.4 籽鹅卵泡颗粒细胞凋亡率的测定

采用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测各组颗粒细胞凋亡率。

1.5 籽鹅卵泡颗粒细胞细胞周期时相性的测定

采用PI单染法检测颗粒细胞细胞周期时相性。

1.6 籽鹅卵泡颗粒细胞Bcl-2与Caspase-3 mRNA表达量的测定

采用荧光定量PCR技术检测Bcl-2与Caspase-3 mRNA表达量。Bcl-2基因引物如下：F: TGAGGCCTTTGTTCGATTTC；R: GCCAGGAAGTTGTTTTGCTC。Caspase-3基因引物如下：F: GATGCAGATGCTGCAAGTGT；R: GAGGGCCATCTGTACCATAGA。

1.7 数据学处理

2 结果

2.1 ENO1基因干扰表达重组质粒的转染结果

将ENO1干扰表达重组质粒转染至原代培养的籽鹅颗粒细胞，转染48 h后转染效率可以达到70%以上(图1)。

Fig. 1 Transfection of shRNA-ENO1 in granulosa cells (uncoulored ×200)

2.2 ENO1基因干扰表达对颗粒细胞增殖的影响

各组颗粒细胞生长曲线均呈“S”形曲线。各组细胞生长96 h数量没有显著差异。Control组细胞生长较快，对数生长期为96～192 h；RNAi组、NC组和Lip组对数生长期为120～216 h。对数生长期内RNAi组细胞数量显著低于其他各组(P<0.05，表1)。

Tab. 1 The growth curve of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 (×105 cells/ml, n=3)

2.3 ENO1基因干扰表达对颗粒细胞凋亡率的影响

荧光定量结果显示RNAi组ENO1 mRNA表达量比Control组、NC组和Lip组都极显著降低(P< 0.01，表2)。

流式细胞术检测结果(图2，表2)显示RNAi组G-mean值与NC组差异显著(P<0.05)，与Control组和Lip组差异极显著(P<0.01)。

Fig. 2 Apoptosis of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h

Tab. 2 ENO1 mRNA and apoptosis of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

2.4 ENO1基因干扰表达对颗粒细胞周期的影响

RNAi组与NC组G0/G1期细胞比例没有显著差异；与NC组和Control组S期细胞比例差异极显著(P<0.01)；与Control组、NC组及Lip组G2/M期细胞比例差异极显著(P<0.01，图3，表3)。

Fig. 3 Cell cycle of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h

Tab. 3 Cell cycle of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

2.5 ENO1基因干扰表达对颗粒细胞Bcl-2与Caspase-3 mRNA表达量的影响

与Control组、NC组及Lip组相比，RNAi组的Bcl-2 mRNA表达量下调(P<0.05)；Caspase-3 mRNA表达量显著上调(P<0.05，表4)。

Tab. 4 Bcl-2 and Caspase-3 mRNA expressions in the granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

3 讨论

ENO1是一种关键的糖酵解酶，可导致已知的“瓦博格效应”，即癌细胞的高糖酵解速率，却不产生高效的能源[12]。研究发现，ENO1在多种肿瘤中高表达，广泛参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭以及转移，在肿瘤代谢方面发挥着重要作用[13-14]。近年来，在癌症疾病中广泛观察到ENO1的异常调节。例如，ENO1是肝细胞癌的潜在生物标志物[15]。ENO1也是一种多功能蛋白，广泛存在于动物机体各个组织、器官之中，参与多种生物学过程。樊等发现ENO1在生物界普遍表达，其表达量与细胞病理生理状况、代谢状态或分裂状态有关[16]。快速增殖是肿瘤细胞的特点，研究表明，癌症细胞存在糖酵解作用取代有氧循环的现象[17]，因为糖酵解能力的增强(等同于乳酸的产生)为细胞生长和增殖提供必要的合成代谢支持[18]。作为家禽生长速度最快的正常组织，卵泡与癌症具有相似的增殖速度，提示其可能也是通过有氧糖酵解获得生长发育必须的能量。Nutt等研究表明，卵母细胞的生长发育需要颗粒细胞提供能量。当缺乏卵丘颗粒细胞时，体外培养的卵母细胞在含有葡萄糖的培养基中也不能生长，同时发现卵泡内糖代谢途径的选择决定了卵泡发育的最终命运[19]，而导致卵泡发育的命运之一—卵泡闭锁的一个直接原因就是颗粒细胞的凋亡[20]。

本实验通过转染发夹RNA敲低ENO1的表达水平，研究了ENO1基因沉默对卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果发现，颗粒细胞ENO1基因沉默后细胞增殖速度变慢，细胞凋亡增加，这与ENO1基因对某些癌细胞的作用相似。高等发现干扰ENO1后明显抑制K562/A02(人慢性粒细胞白血病耐药细胞株)细胞生长[21]。Zuo等研究显示糖酵解酶ENO1与1型跨膜糖蛋白B7-H3相互作用，促进HeLa细胞的恶性化和糖酵解过程，进而促进其增殖[22]。上述实验结果与本实验结果一致，也提示快速增殖细胞的生长速度与糖酵解过程密切相关。此外，ENO1定位于细胞质时对肿瘤细胞的生长和运动具有促进作用[23]，定位于细胞核时则可抑制肿瘤细胞的生长[20]，这也提示本实验ENO1基因重组质粒转染使细胞质中ENO1表达量降低，进而抑制颗粒细胞的增殖。由于ENO1可催化2-磷酸甘油酸为含有高能磷酸键磷酸烯醇式丙酮酸，再被作用产生ATP和丙酮酸[24]。本实验中细胞增殖速度降低，可能是因为磷酸烯醇式丙酮酸生成量减少，ATP含量降低导致。

王等研究发现ENO1过表达使卵泡颗粒细胞Bcl-2基因表达量极显著上调[25]，本实验表明，ENO1干扰表达可使其表达量下调，与其研究结果一致。本实验中ENO1的干扰表达后颗粒细胞生长速度变慢，凋亡率升高，这与Bcl-2及Caspase-3基因表达量变化结果一致。Caspase-3处于细胞凋亡信号通路下游，对肿瘤细胞的研究也显示，Caspase-3使bax基因与bcl-2基因表达失去固有的平衡，使凋亡基因bax占主导地位，从而诱导细胞发生凋亡[26]。有趣的是，Ucker研究发现凋亡细胞表面含有丰富的ENO1，但是ENO1却不具备糖酵解活性，表明ENO1与凋亡密切相关[27]。本实验中发现ENO1干扰表达后颗粒细胞凋亡增加，细胞周期时相性发生改变，Caspase-3 mRNA表达量升高。罗等发现，ENO1干扰表达导致胶质瘤细胞的葡萄糖摄取能力和乳酸产生能力明显降低[28]，进而导致细胞的增殖和细胞周期转化能力也明显下降，这与本研究结果一致。Sun等研究表明，ENO1通过蛋白激酶B(AKT)信号通路增强胃癌细胞增殖和转移，表明ENO1/AKT信号轴可能成为治疗胃癌细胞的潜在靶标[29]。这些都提示ENO1对细胞凋亡和细胞周期存在明确调控作用。

本实验发现ENO1干扰表达籽鹅卵泡颗粒细胞G2/M期细胞比例升高，说明ENO1对其细胞周期具有明显影响。G2/M期和S期是细胞增殖的重要阶段，资料显示细胞在G2/M期难以修复时会被诱导凋亡，而轻微损伤则允许继续存活[30]。综合本实验各项结果，推测ENO1基因干扰可以使原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞发生G2/M期阻滞，损伤难以修复，进而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。

综上，本研究表明ENO1基因干扰表达可使籽鹅卵泡颗粒细胞周期发生G2/M期阻滞，诱导细胞发生凋亡，抑制细胞增殖。