细胞周期蛋白依赖性激酶在miR-193a5p调控卵巢癌细胞增殖及上皮细胞间充质转变中的作用*

杨尊敬， 杜先玲

(恩施州中心医院肿瘤科， 湖北 恩施 445000)

全世界每年约有220,000名女性患卵巢癌，是发达国家妇科恶性肿瘤相关癌症死亡的第四大原因[1]。卵巢癌可分为六个亚组，即浆液性，粘液性，子宫内膜样，移行细胞癌，透明细胞癌和鳞状细胞癌[2]。Feng Y等人[3]通过微阵列数据分析发现miR-193a-5p为改善卵巢癌的化疗敏感性的潜在靶标。Ren X等人[4]发现miR-193a-5p可提高卵巢癌的诊断能力，可以作为候选生物标志物。细胞周期蛋白依赖性激酶14(Cyclin-Dependent Kinase 14, CDK14)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞周期进程和细胞增殖的调节[5]。Zhang W等人[6]发现CDK14的表达与多种临床病理因素相关，包括肿瘤分级，FIGO分期，淋巴结转移，Ki-67表达，并影响卵巢癌细胞增殖，迁移和侵袭。CDK14也可调控癌症细胞的上皮间充质转变(epithelial‐mesenchymal transition, EMT)[7]。然而，miR-193a-5p与CDK14在卵巢癌细胞OVAC中的关系仍未报道。基于此，本研究旨在探讨miR-193a-5p与CDK14在卵巢癌细胞OVAC增殖和EMT之间的关系，为使用miRNA治疗卵巢癌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

miR-193a-5p序列来自miRBase(http://www.mirbase.org/)，miR-193a-5p mimics和miR-193a-5p inhibitor由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-193a-5p SYBR Green miRNA荧光定量PCR试剂盒购自HaiGene公司(货号：AP02314、批号：CUDIV6B2)。miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自上海沪震实业有限公司(货号：HZ130911-25、批号：IU13I1)。CDK14, E-cadherin，vimentin、fibronectin、TUBULIN抗体购自abcam公司(货号：ab175489、批号：46731034134；ab1416、批号：06137773828；ab8978、批号：97772918624；ab32419、批号：97299240093；ab32124、批号：13573127795)。OVAC细胞购自厦门慧嘉生物科技有限公司(货号：X1278、批号：GB1BK1)。RPMI-1640培养基购自武汉纯度生物科技有限公司(货号：CD-100043GM、批号：O58963)，优级胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司(货号：11011-8611、批号：F40I58SOSD26EYZ)。蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA, mini片剂) 购自bimake公司(货号：B14011、批号：K6LJZ3NF)。PBS购自天津泰泽兴业生物科技有限公司(货号：MA0015、批号：3FBJ9FYKVDD3LA5)。青链霉素混合液(100×)购自上海亿言生物科技有限公司(货号：SL6040-100 ml、批号：CQ83GF1KGP16)。2×SDS 蛋白电泳上样缓冲液购自上海樊克生物科技有限公司(货号：FK-ZH536J、批号：9HHKR0Q3)。快速蛋白裂解液购自上海信裕生物科技有限公司(货号：XY-3221-1、批号：H867MTG8R17C0-P)。cyclofect转染试剂购自大连兴典生物科技有限公司(货号：cyclofectalpha001a、批号：KT1YPT3Q)。P3mirGLO质粒购自优宝生物公司(货号：VT1439、批号：NT98-WBKH8WPK-2)。Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒购自齐一生物科技(上海)有限公司(货号：K801-200、批号：63698282970)。MTT试剂盒购自上海浩然生物技术有限公司(货号：M2128、批号：1W3BQQS8HBV)。CCK-8试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司(货号：E1CK-00208、批号：406MIKO2)。

1.2 荧光素酶报告试验检测miR-193a-5p靶向CDK14

将CDK14的3‘UTR克隆进P3mirGLO质粒，同时克隆CDK14的3‘UTR的UG突变进P3mirGLO质粒。将每孔总共5×104个OVAC细胞接种在24孔板中。培养24 h后，用含有200 ng/ml双荧光素酶报告质粒和40 nmol/L miR-193a-5p mimics混合后转染细胞。使用荧光素酶报告检测试剂盒在转染后24 h通过酶标仪测量荧光素酶活性。所有转染独立重复至少三次。

1.3 细胞培养和转染

卵巢癌细胞OVAC在37℃ 5% CO2含有100 U/ml青霉素-100 μg/ml链霉素和10%热灭活的FBS的RPMI-1640培养基中孵育。通过cyclofect转染试剂转染卵巢癌细胞OVAC。将miR-193a-5p mimics或miR-193a-5p inhibitor与cyclofect脂质体混合，静止大约20 min后，缓缓滴入OVAC细胞，转染后24 h进行下游实验。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-193a-5p的相对表达量

将卵巢癌细胞OVAC用细胞刮刮下，装入 1.5 ml的EP管中，用PBS洗3次。使用miRNA快速提取试剂盒抽取OVAC的miRNA。使用miRNA反转录试剂盒将纯化好的总miRNA进行逆转录。用miR-193a-5p SYBR Green miRNA荧光定量PCR试剂盒在ABI7500仪器上进行qPCR反应，实验重复三次。使用2-ΔΔct值表示结果。

1.5 免疫印迹检测CDK14、E-cadherin、vimentin、fibronectin、TUBULIN的表达

进行10%SDS-PAGE的电泳[8]，然后转移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔径)。将PVDF膜在室温下在含有0.01%Tween-20和5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5,150 mmol/L NaCl)中封闭1 h，然后在4℃下与目的蛋白的抗体(CDK14：1∶1 000, E-cadherin：1∶3 000，vimentin：1∶3 000、fibronectin：1∶3 000、TUBULIN：1∶8 000)温育过夜后将膜在室温下与缀合有HRP的相应二抗孵育1 h。用ECL Plus Western印迹检测系统观察特定蛋白质[9]。

1.6 MTT试验检测UVAC细胞活力

第1日用卵巢癌细胞OVAC细胞，将OVAC细胞稀释至7.5×104cells/ml。向96孔板的每个孔中加入100 μl细胞并孵育过夜。第2日进行过表达miR-193a-5p或者基因沉默miR-193a-5p处理细胞。第3日，向每个孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT。在培养箱中37℃孵育3.5 h。用锡箔覆盖并在轨道振荡器上搅拌细胞15 min。读取590 nm处的吸光度。

1.7 CCK-8实验检测UVAC细胞增殖

在96孔板中分配100 μl OVAC细胞悬浮液(5×103cells/ml)。将板在潮湿的培养箱中预孵育24 h(37℃，5% CO2条件下)。将10 μl不同浓度的待测物质加入板中。将培养板在培养箱中孵育适当的时间(0 d、1 d、2 d、3 d、4 d)。再向每个孔中加入10 μl CCK-8溶液。将培养板在培养箱中孵育4 h。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 转染miR-193a-5p mimic后对CDK14 3’UTR的荧光素酶相对活性的影响

通过Targetscan在线工具分析，发现miR-193a-5p与CDK14的3‘UTR高度匹配，且匹配区域位于3‘UTR的160-166位置。将匹配区域做UG突变，发现miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR(P<0.05，图1，表1)

Tab. 1 miR-193a-5p targets CDK14

2.2 过表达miR-193a-5p后对卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT的影响

转染miR-193a-5p mimics后，通过q-PCR检测到miR-193a-5p的表达量增高(P<0.05, 1.03±0.11vs1.78±0.05)。裂解细胞后，通过WB检测到CDK14的表达量下降(P<0.05)，EMT相关蛋白质E-cadherin的表达量上升(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表达量下降(P<0.05，图2)。并且，过表达miR-193a-5p后，卵巢癌细胞OVAC的增殖和细胞活力均增加(P<0.05，表2，表3)。

Fig. 2 Overexpression of miR-193a-5p, WB detects CDK14 and EMT-related protein expression

Tab. 2 CCK-8 detects cell proliferation after overexpression of miR-193a-5p

Tab. 3 The activity of MTT cells after overexpression of miR-193a-5p

2.3 基因沉默miR-193a-5p后对卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT的影响

转染miR-193a-5p inhibitor后，通过q-PCR检测到miR-193a-5p的表达量下降(P<0.05, 1.04±0.12vs0.32±0.05)。裂解细胞后，通过WB检测到CDK14的表达量上升(P<0.05)，EMT相关蛋白质E-cadherin的表达量下降(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表达量上升(P<0.05，图3)。并且，基因沉默miR-193a-5p后，卵巢癌细胞OVAC的增殖和细胞活力均下降(P<0.05，表4，表5)。

3 讨论

卵巢癌是女性因癌症而死亡的第四大原因，其整体5年生存率约为30%[10]。由于卵巢癌的早期临床症状不典型，大约70%的患者在诊断时肿瘤已经超出卵巢传播到盆腔和腹腔器官。尽管近年来已经应用了外科手术和细胞毒性治疗，但卵巢癌的5年生存率仍只有30%。这主要是因为对卵巢癌发生发展的分子机制了解不够深入。因此，进一步研究促进卵巢癌进展的分子机制对于寻找新的治疗方法和改善这种疾病的预后将是有意义的。

Fig. 3 Detection of CDK14 and EMT-related protein expression by WB after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 4 CCK-8 detects cell proliferation after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 5 MTT assay for cell viability after knockdown of miR-193a-5p

miRNA是一种微小的非蛋白质编码RNA，通过与靶mRNA中部分互补的靶位点相互作用，在转录后调节基因表达。越来越多的研究者在卵巢癌中进行了miRNA表达谱分析[11]。 例如， miR-106b，miR-143，miR-145，miR-125b等具有致癌功能的miRNA; miR-30，miR-124和miR-199等具有肿瘤抑制作用的miRNA[12-15]。在本研究中，发现miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR的160-166位置。过表达miR-193a-5p后， CDK14的表达量下降；但基因沉默miR-193a-5p后， CDK14的表达量上升。CDK14已被证明在控制细胞周期进程和细胞增殖中发挥关键作用[16]。提示miR-193a-5p可能调控卵巢癌的细胞周期进程和细胞增殖。

最近，有证据表明CDK14在几种恶性肿瘤中表达增加，例如食道癌，肝细胞癌，乳腺癌，并参与细胞周期，肿瘤增殖，侵袭，迁移的调节，这进一步影响了肿瘤的预后[17]。在本研究中，miR-193a-5p引起的CDK14表达降低，导致CDK14的表达量下降，卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT的上升；同时，基因沉默miR-193a-5p导致CDK14表达量的上升，造成卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT的下降。CDK14参与控制真核细胞周期，其活性由相关的细胞周期蛋白控制。CDK14通过与CCDN3的相互作用，作为细胞周期进展和细胞增殖的促进因子。因此，miR-193a-5p通过靶向CDK14的3‘UTR以减少CDK14在mRNA水平上降低，进而导致CDK14在蛋白水平上下降，与CCDN3相互作用的CDK14蛋白减少，CCDN3促进增殖和细胞活力的能力降低，最终导致卵巢癌细胞OVAC的增殖、细胞活力和EMT的减少。基因沉默CDK14后能够抑制胰腺癌细胞的增殖，侵袭和迁移并抑制EMT的进展[18]。提示miR-193a-5p可能是在多种癌症中被抑制，如果通过体外合成miR-193a-5p的注射至患者的癌组织或癌组织被切除的部位可能会抑制癌症的复发。但是，miR-193a-5p具体的剂量和给予方式需要进一步探索。尽管卵巢癌有6种类型，但是本研究仅在细胞水平探讨miR-193a-5p的作用机制，具体miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR可应用于哪一种癌症仍然需要进一步的探索。在上皮性卵巢癌中， CDK14在上皮性卵巢癌细胞系和上皮性卵巢癌组织中均过表达，CDK14表达水平与肿瘤分级，淋巴转移以及预后不良有关[19]。本研究创新性地报道了卵巢癌中基于 miR-193a-5p 的CDK14高表达的潜在机制，miR-193a-5p成为潜在的靶向治疗卵巢癌的miRNA。在体外合成miR-193a-5p后，可通过藕连某个特异性识别卵巢癌的分子靶向进入卵巢癌细胞内，通过降解CDK14的mRNA来达到抑制或治疗卵巢癌的目的。因此，本研究丰富了miRNA在卵巢癌发生发展的潜在功能，并为小分子RNA治疗卵巢癌提供了理论基础。