白花蛇舌草对人胃癌细胞MNK-45线粒体膜电位及凋亡相关基因表达的影响*

杜 洋， 邵淑丽,2△， 焦凯贺， 刘祥露， 冯 元， 张伟伟,2

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目前，胃癌(gastric carcinoma, GC)是致死率极高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康[1]。胃癌在不同的时期治疗的手段也各不相同，但大多的治疗方式还是以外科手术为主，辅以放、化疗和药物治疗等综合治疗[2]。尽管伴随着我国诊疗科学的高速发展，但还是有大约90%以上的胃癌患者在接受外科手术治疗后死于术后复发[3]。而化疗则有一些不同，可以在一定程度上提高患者的生存率，但常规的化疗药物化疗后会出现临床上的不适症状和生物免疫功能降低的情况[4]。因此, 寻找环保、毒副作用小和治疗胃癌效果明显的药物成为研究工作的重点。白花蛇舌草最早被记载于《广西中药志》中，隶属于茜草科耳草属，一年生披散草本植物[5]。白花蛇舌草的化学成分中含有多种抗肿瘤的相关成分, 而这些成分则主要通过诱导癌细胞凋亡[6]、抑制肿瘤组织血管及淋巴管生成[7]、调控相关信号通路[8]、调节机体免疫功能[9]、抗氧化[10]等途径实现对肿瘤细胞的抑制作用。然而关于白花蛇舌草对人胃癌 MKN-45细胞线粒体膜电位及相关基因表达的影响尚未见报道。因此, 本实验运用流式细胞术、qRT-PCR和Western blot等方法研究不同浓度药物作用MKN-45细胞48 h后对细胞线粒体膜电位及凋亡相关基因的影响，为白花蛇舌草的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人胃癌MKN-45细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所。白花蛇舌草(注射液)购自南通飞宇生物制品有限责任公司，其浓度为 1 g/L。优级胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640培养基干粉购自Gibico公司。UN1Q-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒、全蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。Cytc、caspase3和caspase9抗体购自北京博奥森生物技术公司。兔抗、鼠抗二抗购自美国LI-COR公司、Power 2×SYBR real-time PCR premixture试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及药物配制

MNK-45细胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素的完全培养液中, 于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行培养。白花蛇舌草(注射液)经0.22 μm的滤器无菌过滤后, 配置成终浓度为20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草，按100 μl每管分装, 放于4℃冰箱保存备用。将人胃癌细胞MNK-45分成4组，每组设置3个复孔，对照组为含未加入白花蛇舌草的MNK-45细胞；3组实验组分别加入终浓度为20、30、40 μg/ml白花蛇舌草的MNK-45细胞；各组在5%的二氧化碳培养箱中孵育48 h后，利用激光共聚焦显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞术检测线粒体膜电位，qRT-PCR检测Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9基因的表达变化，Western blot检测Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9蛋白的表达变化。

1.3 激光共聚焦显微镜下观察细胞形态

将爬片放入到6孔板中，接种MNK-45细胞，待细胞生长至对数生长期, 分别加入终浓度为0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草, 培养48 h后, 先用1 ml 4%多聚甲醛固定MNK-45细胞，再用浓度为0.5 μg/μl的吖啶橙200 μl在室温条件下孵育3～5 min, 激光共聚焦显微镜下观察细胞核变化并拍照。

1.4 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位

收集终浓度为0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草处理48 h后的人胃癌MNK-45细胞，并将细胞重悬于500 μl稀释好的Rho-123染色液中, 2 000 r/min离心5 min，用1xPBS洗两次后在500 μl 1×PBS中重悬，进行流式细胞仪的上机检测。

1.5 qRT-PCR检测mRNA表达

根据Cytc、caspase3、caspase9和β-actin基因的序列, 用Primer Premier 5设计PCR引物。Cytc基因上游引物序列(F)为： 5′-CTG GGT GAC GAG TGA AAC TG-3′, 下游引物序列(R)为： 5′-TGA GCA CAA CAG GAA CTG GA-3′, 扩增产物长度为104 bp。caspase3基因上游引物序列(F)为： 5′-GGA ACG AAC GGA CCT GTG-3′, 下游引物序列(R)为： 5′-GCC TCC ACT GGT ATC TTC TG-3′, 扩增产物长度为135 bp。Caspase9基因上游引物序列(F)为： 5′-CCA GAT GCT GTC CCA TAC C-3′, 下游引物序列(R)为： 5′-ATT GGC GAC CCT GAG AAG-3′, 扩增产物长度为228 bp。β-actin基因上游引物序列(F)为： 5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′, 下游引物序列(R)为： 5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′, 扩增产物长度为205 bp。收集终浓度为0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草处理48 h的人胃癌MNK-45细胞, 使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA, 并将其逆转录成cDNA。以该cDNA为模板, β-actin为内参, 每组实验设有3个重复后，进行qRT-PCR检测。得到的Ct值采用2-ΔΔCt计算获得不同药物浓度组别细胞中Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的相对表达量。

1.6 Western blot检测蛋白表达

收集终浓度为0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草处理48 h的人胃癌MNK-45细胞, 用蛋白裂解液裂解细胞提取细胞全蛋白后, 将蛋白煮沸变性进行SDS-PAGE凝胶电泳, 然后电转移到NC膜上，使用脱脂奶粉和PBS的混合封闭液封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，PBST洗后二抗孵育1 h，再用PBST洗后上机进行扫描检测。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 白花蛇舌草对人胃癌 MKN-45细胞形态的影响

结果表明，0浓度组细胞大小均一，细胞核清晰且体积较大，呈正圆形，并有完整的细胞膜包被。与0浓度组相比，20、30、40 μg/ml白花蛇舌草处理组随着白花蛇舌草浓度的不断升高细胞大小不在均一并伴随体积缩小的现象，细胞形态变为不规则状态，细胞膜皱缩，细胞内的染色质高度聚集呈现边缘化，视野下细胞数明显减少，出现细胞碎片甚至破裂现象，出现明显的凋亡小体(图1)。

Fig. 1 The cell morphology of human gastric cancer MNK-45 cells treat with Hedyotis diffusa for 48 h under confocal microscopy (acridine orange, Bar=10 μm)

2.2 白花蛇舌草对人胃癌 MKN-45细胞线粒体膜电位的影响

结果表明，0浓度组细胞的线粒体膜电位为 96.4±1.96，而在终浓度为20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草处理下细胞的线粒体膜电位分别为90.9±1.67、73.0±1.16和17.4±0.81，与0浓度组相比均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01，图2，表1)。

Fig. 2 Detection of mitochondrial membrane potential of human gastric cancer MNK-45 cells treated with hedyotis diffusa for 48 h (n= 3)

Tab. 1 Detection of mitochondrial membrane potential and Cyt c, caspase3 and caspase9 mRNA expressions in MNK-45 cells n=3)

2.3 白花蛇舌草对人胃癌 MKN-45细胞Cyt c、caspase3和caspase9基因mRNA的影响

结果表明，与0浓度组相比，随着白花蛇舌草药物浓度的升高，Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的表达均有不同程度的升高(P<0.01，表1)。

2.4 白花蛇舌草对人胃癌 MKN-45细胞Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表达的影响

结果发现,与0浓度组相比，随着白花蛇舌草药物浓度的升高，Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表达升高，由于caspase3和caspase9蛋白发挥作用的形式是剪接激活，因此伴随着蛋白剪接体的从无到有线粒体途径的凋亡现象也逐渐明显，caspase3的蛋白剪接体cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接体cleaved-caspase9蛋白的含量升高(P<0.05,P<0.01，图3，表2)。

Tab. 2 The effects of Hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 n=3)

Fig. 3 The effects of hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 ( n= 3)

3 讨论

胃癌是全球性的恶性疾病且发病率居高不下。目前为止，化疗是现阶段最有成效的治疗手段之一，但现有的化疗药物大多都有较大的毒副作用，而白花蛇舌草作为一种天然中药，其毒副作用明显小于化学合成的药物，且在抗肿瘤方面显示良好的药理活性[5,6]。曾珠等人也发现白花蛇舌草能够抑制肺癌干细胞的增殖, 促进其凋亡, 使细胞被阻滞于G1期[11]。李等人也发现白花蛇舌草能够抑制结肠癌细胞的转移, 抑制其淋巴管形成, 使VEGF-C的表达下降[12]。本研究中显示，白花蛇舌草可以诱导胃癌细胞的凋亡，经过20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草孵育48 h后，人胃癌MNK-45细胞数量明显低于对照组，凋亡现象明显，在终浓度为40 μg/ml时对MNK-45细胞凋亡的诱导最为明显。

细胞凋亡则是机体自身使细胞程序性死亡的生理过程，其存在着死亡受体[13]、线粒体通路和内质网通路[14]三条通路，其中线粒体通路在细胞凋亡过程中起着重要作用，是细胞凋亡的主要途径之一[15,16]。李凤岩等人发现甘草次酸可以促进甲状腺癌细胞SW579的凋亡[17]。洪凯等人的研究发现2-12烷基-6-甲氧基环己基-2,5-二烯-1,4-二酮能激活OCI-LY19细胞线粒体凋亡的内源性通路而促进弥漫大B淋巴瘤细胞凋亡，抑制OCI-LY19细胞增殖，具有抗弥漫大B淋巴瘤的作用[18]。线粒体凋亡机制是通过改变线粒体膜的通透性，将细胞色素C等凋亡蛋白释放到细胞质中，此后，细胞色素C与凋亡酶激活因子1(Apaf-1)和caspase9形成凋亡体，caspase9自我剪切活化，然后在ATP等存在下将无活性的caspase3酶原剪切激活，从而引起细胞凋亡[19]。在本研究中，20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草均可以降低MNK-45细胞线粒体膜电位，并使凋亡相关基因Cytc、caspase3和caspase9基因的表达显著升高，且caspase3的蛋白剪接体cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接体cleaved-caspase9蛋白的含量升高。其中在白花蛇舌草的终浓度达到40 μg/ml时线粒体膜电位降低至最低，Cytc、caspase3和caspase9基因的表达升至最高。提示白花蛇舌草刺激人胃癌MNK-45细胞后可能通过引起线粒体膜通透性改变，降低线粒体膜电位，释放Cyt c，促发caspase细胞凋亡级联反应，caspase-3凋亡途径被激活并参与白花蛇舌草诱导的人胃癌MNK-45细胞凋亡机制。由于药物对人胃癌MNK-45细胞蛋白质的表达需要一定周期，基因表达的改变一般发生在给药的24 h后，但是出现蛋白质改变一般要晚于基因表达，因此本实验在48 h对目的蛋白进行检测。这与蒋显发现的药物可诱使线粒体释放凋亡因子使线粒体膜电位降低促使细胞凋亡的结果一致[20]。

综上所述，白花蛇舌草能够使人胃癌MNK-45细胞线粒体膜电位降低，上调Cytc、caspase3和caspase9基因表达，诱导细胞凋亡，进而发挥抗胃癌的作用。白花蛇舌草较为常见，价格低廉，本研究结果可为其在肿瘤临床治疗中研发应用提供实验依据。