小麦四个多效抗病基因的分子检测

李 玮，宋国琦，李吉虎，李玉莲，张淑娟，张荣志，高 洁，谷田田，李根英

(山东省农业科学院作物研究所，山东济南 250100；农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，山东济南 250100)

小麦锈病(条锈病、叶锈病、秆锈病)和白粉病是全世界流行的小麦真菌性重大病害，可通过空气远距离传播，具有病原菌生理小种复杂多变、分布广泛、爆发性强等特点，大发生时可造成严重的产量损失[1-4]。多效抗病基因是小麦中发现的一类宝贵基因资源，在小麦中已经发现的多效抗病基因有四个，包括Lr27/Yr30/Sr2[5]、Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[6]、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58[7]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[8]，它们对小麦锈病和白粉病同时具有抗性。利用多效抗病基因培育兼抗型品种是防治小麦锈病和白粉病经济有效和环境友好的途径。

分子标记辅助选择是分子育种的有效技术手段，利用分子标记对小麦品种品系进行分子检测是开展分子育种的工作基础。四个多效抗病基因中Lr34[9]和Lr67[10]已经被克隆，其分子标记分别为cssfr1～7[11]和TM4、TM10。Sr2被定位在小麦品种Hope3B染色体867 kb的物理区段内，含有34个基因，其中仅有17个与中国春参考基因组中已注释的基因存在对应关系[12]，CAPS标记csSr2[13]位于其中，可用于辅助选择。Lr46最早被发现于小麦品种Pavon76中，目前最有效的分子标记是csLV46[7,14]，但该基因尚未被克隆。张亚琦[2]报道CAPS标记csLV46G22也可用于检测Lr46。2016年Rasheed[15]开发了与cssfr5、cssfr7和csSr2对应的KASP标记Lr34_TCCIND、Lr34jagger和Sr2_ger9 3p。

为了更好地了解多效抗病基因在小麦育种材料中的携带情况，本课题组利用目前获得的最有效的分子标记对本团队收集保存的小麦材料进行检测分析，并将这些结果输入到本课题组开发的“小麦分子育种信息共享系统”(http://123.232.115.143:8097/Framc/Login.htm)，以期为促进小麦分子标记检测结果的共享利用和我国小麦抗病分子育种发展贡献绵薄之力。

1 材料与方法

1.1 材 料

共检测小麦品种(系)367份，其中240份为中国农科院作物所小麦亲本创制与新品种选育团队提供的来自全世界的遗传多样性资源材料，其余127份为本团队收集的育种亲本(大部分来自黄淮冬麦区)。另外，中国春为Lr34的阳性对照，Pavon 76(楚秀生老师提供)为Lr46和Sr2的阳性对照，NP876(兰彩霞老师提供)为Lr67的阳性对照，济麦229(李豪圣老师提供)为阴性对照。供试小麦品种(系)于2018年10月5日种植于山东省济南市试验基地，利用播种机(Wintersteiger，奥地利)点播，行距33 cm，行长4 m，株距 5 cm，按行长划排，排间留1 m的田间走道。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

取苗期单株叶片约0.1 g放入2 mL离心管中，加入1个直径6 mm钢珠放入液氮中冷冻，然后用SPEX公司Geno/Grinder 2010组织研磨机进行研磨，研磨条件为850 r·min-1，20 s。用天根公司快捷型植物基因组DNA提取系统(非离心柱型)提取DNA，加去离子水溶解，调整DNA浓度约100 ng·μL-1，转移至96孔板保存。

1.2.2 PCR检测

Lr34和Sr2分别以分子标记cssfr5和csSr2进行检测。由于csSr2原引物组合扩增效果不稳定，根据公布的csSr2所在区段DNA序列设计引物Sr2-637R(5′-CCCTGCTATCATCATAATCAGTC-3′)与原引物csSr2F组合进行检测。PCR反应体系为10 μL，包括5 μL Mix(擎科，青岛)，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL(擎科，青岛)，DNA 1 μL，去离子水3 μL。采用384孔PCR仪Veriti(AB，美国)进行PCR，PCR反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃或60 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 50 s；72 ℃ 3 min。对csSr2的PCR产物进行酶切，酶切体系为10 μL，包括 1 μL 10×缓冲液CutSmart，5 μL PCR产物，0.2 μL BspH Ⅰ(NEB，北京)和3.8 μL去离子水，37 ℃孵育20 min。PCR产物或酶切产物用GoldView Ⅱ型(索莱宝，北京)染色，用1.5%或2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，Marker为DL2000(擎科，北京)，采用Universal Hood Ⅱ(伯乐，美国)拍照。

1.2.3 KASP检测

对cssfr5检测Lr34为阳性的材料进一步用KASP标记Lr34jagger检测是否存在Jagger类型变异。Lr46和Lr67分别以Lr46_JF2-2和TM10进行检测。KASP反应体系为5 μL，包括2.5 μL Master Mix(LGC，北京)，10 μmol·L-1引物混合0.3 μL(KASP有3条引物，按C∶F∶H=5∶2∶2比例混合，其中C为共用引物，F为Fam类型位点特异引物，H为Hex类型位点特异引物)(Invitrogen，北京)，DNA 1 μL，去离子水1.2 μL。反应程序参考KASP标准程序，仅Touchdown起始温度设为65 ℃，每个循环下降 0.8 ℃。用PHERAstar(LGC，英国)KASP荧光检测仪进行检测，用KlusterCaller软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 多效抗病基因检测结果

cssfr5是由两个显性标记组合而成的共显性标记，但是两个标记之间存在相互干扰的现象，因此实验中对其分开检测。在Lr34出阳性材料中，利用引物L34SPF和L34DINT13R2组合可以在样品DNA中扩增出751 bp的片段(图1)；在Lr34阴性材料中，利用引物L34DINT9F和L34MINUSR组合可以在Lr34阴性样品的DNA中扩增出523 bp的片段(图2)。对cssfr5检测为阳性的材料进一步用 Lr34jagger检测是否存在基因提前终止变异(Jagger类型)，如果检测结果为Hex类型(红色)，则对应基因存在提前终止变异，材料中Lr34为阳性；如果检测结果为Fam类型(蓝色)，则对应基因无提前终止变异，材料中Lr34为阴性(图3)。

图3 Lr34 Jagger检测结果

图2 部分材料的 Lr34阴性标记检测结果

M：DL2000；CK：中国春；1：河农5480；2：汶农19；3：JNM3070；4：济麦262；5：邢麦13号；6：京双16；7：975106；8：山融3号。图2同。

在含有Sr2的材料中，使用scSr2标记对应的引物可在其DNA中扩增出484 bp的片段(图4)，酶切后可得到317 bp、114 bp和53 bp的条带，在不含Sr2的材料中，同样的引物在样品，DNA中无扩增片段，或者扩增片段酶切后得到370 bp和114 bp的条带。实验中，53 bp的片段在酶切和电泳过程中会变弱或消失，可根据317 bp和370 bp的条带差异来判断是否含有Sr2(图5)。

M：DL2000；CK：Pavon76；1：泰山6436；2：和尚头；3：BFB10；4：中麦23；5：齐麦2号；6：烟1212；7：烟农578；8：济麦229。图5同。

图5 部分材料的csSr2酶切结果

利用KASP标记Lr46_JF2-2对材料样本进行检测，若检测结果为Hex类型(红色)，则材料中Lr46为阳性；若检测结果为Fam类型(蓝色)，则材料中Lr46为阴性(图6)。与Lr34和Sr2的检测结果相比，Lr46的检测结果存在假阳性，因此结果中阳性率很高(csLV46G22的阳性率更高，所以本研究未采用)。采用KASP标记TM10对材料进行检测，若检测结果为Hex类型(红色)，则材料中Lr67为阴性；若检测结果为Fam类型(蓝色)，则材料中Lr67为阳性(图7)。

图6 Lr46检测结果

图7 Lr67检测结果

对检测结果进行统计，发现共有174样次多效抗病基因的分子标记检测结果为阳性，其中含有Lr34的材料有23份(26份cssfr5阳性，其中3份为基因存在提前终止变异的Jagger类型)，含有Sr2的有12份；含有Lr46的有138份；仅在对照品种NP876中检测到Lr67，表明Lr67在国内外材料中被利用均较少。

2.2 品种(系)携带多效抗病基因情况

在检测的367份小麦材料中，不含多效抗病基因的材料有203份，占检测总数的55.31%；含有一个多效抗病基因的有155份，占检测总数的42.23%；含有两个多效抗病基因的有8份，占检测总数的2.18%；含有三个多效抗病基因的仅有1份，占检测总数的0.27%，表明同时利用多个多效抗病基因的品种(系)较少。

在携带一个多效抗病基因的155份品种(系)中，17份材料含有Lr34，分别是BRUTA、DONSKI-93、F498U1-1021/BOEMA、F92080G1-1/F93042G2-1、F98047G14-2INC、HK1、Kanto 107、MV05-08、ProINTA Colibr 1、Salmone、和尚头、淮麦21、山融3号、陕512、洋小麦、中国春、周麦13；8份材料含有Sr2，分别是Dorico、Kitanokaori、淮麦20、济南13、济宁16、鲁麦21、齐麦2号、周麦25；129份材料含有Lr46，分别是11CA40、3D232、Aca 601、Aztec、Blu99603、C39、CA0816-R、CA0816-W、CA0958、CA0998、CA1062、CA1119、CA1133、CA1135、CA9722、Carimulti、E、Fr03717、Fr03725、Fr03732、Fr03733、Fr3713、Genio、Insignia、Jagger/W94-244-132、K03566、Klein Flecha、Klein Jabal 1、LASEN、Libero、LS4695、Manital、Mantol、Mesofold、Nidera Baguette 10、PH82-2、Sagittario、Sunstate、北京841、藁城8901、藁优5218、藁优5766、观35、河农5480、河农7069、菏麦0662、菏麦20、衡7228、衡观33、衡观35、济麦262、济南17、冀麦181、冀师02-1、金麦1号、晋麦45、晋麦61、晋麦67、京411、京9428、京冬17、京冬22、京冬8号、京双16、京双16、临抗12、临麦2号、临麦4号、临麦6号、临麦8号、临选5186、临优145、临优359、临远3158、临远6521、鲁麦11、鲁麦23、鲁麦5号、鲁麦7号、鲁麦8号、轮选987、内乡188、农大211、农大212、濮兴5号、秦农151、秦农731、儒麦1号、陕229、陕253、陕715、陕农78-59、陕农981、石新733、石新828、泰农1014、泰山22、泰山23、泰山23号、泰山6436、皖麦33、皖麦38、汶农17、汶农6号、西农2000-7、西农88、小偃6、小偃81、新18391、新麦26、新麦37、新麦9号、烟85771、烟农15、永4896、豫麦18、豫麦47、豫麦49、豫麦57、郑麦366、中麦175、中麦23、中麦415、中优206、中优335、中优9507、周8425B、周麦12和周麦23。

在携带两个以上多效抗病基因的9份品种(系)中，6份为国外材料，3份为中国材料。其中，郑麦9023、西农1376和对照品种Pavon76含有Sr2和Lr46；TX03A0148、lasen、MV LAURA、Mason/Jagger和德抗961含有Lr34和Lr46；仅Aca 801含有Lr34、Sr2和Lr46三个基因。

3 讨 论

多效抗病基因除了兼抗锈病(条锈病、叶锈病和秆锈病)和白粉病的优点外，还具有抗病谱广、抗病性持久等特点。Mcfadden[16]在1930年就报道了含有Sr2的小麦品种Hope具有良好的秆锈病抗性，1976年小麦Pavon76在墨西哥审定，Singh等[17]发现其含有Lr46；1977年Dyck在中国引入加拿大的材料PI58548中发现了Lr34[18-19]，1979年Dyck[20]在巴基斯坦小麦PI250413中发现一个成株抗叶锈基因，后被命名为Lr67。这四个基因从发现至今已有40～90年，在生产上仍具有较好抗性。但在本研究的检测结果中，携带Lr34的材料仅有26份，携带Sr2的材料仅有12份，而同时携带两个以上多效抗病基因的中国材料仅有3份，这与前人的检测结果基本一致。

导致这种现状的原因可能是多效抗病基因属于成株抗性，在苗期抗病性较差甚至表现为感病而且单个基因的作用较小，在常规育种过程中容易丢失，所以在现有的品种(系)中，检测到同时携带多个多效抗病基因的材料较少。在常规育种过程中以分子标记进行辅助选择是利用多效抗病基因行之有效的方法。目前Sr2和Lr46基因还未被克隆，只有连锁标记可以用。Sr2的紧密连锁标记csSr2距离基因很近，可以用于辅助选择，不过Sr2基因位点在大多数小麦材料中存在大片段缺失，即不能利用PCR对csSr2片断进行扩增，csSr2在生产上多数是显性标记，在育种后代无法区分杂合子和纯合子。利用KASP标记Lr46_JF2-2对基因Lr46检测时，尽管存在假阳性结果，但如果杂交组合的亲本存在多态性仍然可以用于辅助选择，这种情况也适用于另一个分子标记csLV46G22。功能标记(functional marker)是功能基因克隆之后根据等位基因变异开发的分子标记[21]，在抗病育种过程中利用Lr34和Lr67的功能标记进行选择，可省去抗病鉴定环节，做到事半功倍。

根据已报道[15]的结果Lr34_TCCIND和Sr2_ger9 3p这两个KASP标记检测结果较好，但本研究依据这两个分子标记进行检测，结果无法进行分型，且大量测试实验后效果一直没有得到改善。此外，cssfr5和csSr2这两个标记检测效果不稳定，以致于后期效果变差甚至无法扩增，将cssfr5拆开检测，并且重新设计csSr2引物才解决此问题。因此在开发分子标记时，可以针对同一个基因开发多个分子标记或多种类型的分子标记。多个分子标记可以在一个标记效果不好时有其他标记可以替代，多种类型的分子标记可以降低使用门槛。例如现在SNP标记一般都设计成KASP标记，但对于没有KASP检测设备的单位(比如地市级农科院所和中小型育种公司)就无法进行KASP检测，如果同时开发为dCAPS标记，就可以为分子标记在育种中的应用提供便利 条件。

Lr34是第一个被克隆的多效抗病基因，后续研究表明Lr34可以增强其他多效抗病基因的抗性[22-23]，在Lr34转基因的水稻[24]、大麦[25-26]、硬粒小麦[27]、玉米[28]和高粱[29]中对多种病害均具有抗病性。可见多效抗病基因作为一类独特的基因资源具有巨大的应用价值和广阔的利用空间。Lr67为第二个被克隆的多效抗病基因，对种质材料的分子标记检测结果表明，该基因在小麦品种(系)中的分布极少，在被检测的中国材料中仅在三个地方品种(品种名称已经不可考)中检测到[10]，本研究的检测结果也证实了这一点。因此在育种过程中利用分子标记辅助选择聚合多个多效抗病基因，同时增加对Lr67的利用将有利于我国对小麦生产中锈病和白粉的防控。为方便科研人员了解小麦已开发的分子标记，掌握亲本材料的分子标记检测结果，我们开发了“小麦分子育种信息共享系统”，收录了部分公开发表的分子标记和检测结果，只需要简单注册就可以登录查看，本研究结果也将在整理后导入该系统。欢迎各位同行与我们联系，在“小麦分子育种信息共享系统”中分享数据，共赢互惠。