西藏高原主要麦类作物真菌毒素污染与产毒真菌分布研究

魏 娜，岳晓凤，余秋玉，张飞龙

(1.西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，西藏拉萨 850032； 2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉 430062)

青稞、小麦在西藏种植历史悠久，播种面积大，适应范围广，从海拔2 500 m以下的河谷坡地到4 200 m左右的湖滨平原(青稞种植上限最高可达海拔4 500 m)均有种植，其中青稞是西藏优势特色作物和藏民族赖以生存繁衍的基本口粮作物，种植面积占粮食生产总面积的70%左右，且具有高营养、高保健功能、高附加值等特点[1]。小麦在西藏粮食生产中仅次于青稞，从藏东南湿润、半湿润地区到西部半干旱、干旱地区广大农区均有种植。因此，青稞、小麦质量安全直接关系到西藏农业发展和人民的身体健康。真菌毒素是由曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)等真菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染谷物、食品以及饲料等，可致癌、致畸、致突变，严重威胁人畜健康[2]。目前，已发现超过400种真菌毒素，其中黄曲霉毒素(aflatoxins)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA)、伏马毒素B(fumonisinB)、T-2毒素等是污染谷物的主要真菌毒素，可发生在作物田间生长阶段或收获后储藏阶段[3]。真菌毒素对粮食作物的污染是一个全球普遍存在的问题，包括我国在内的世界各国的农产品都不同程度地遭受真菌毒素污染。西藏高原是地球上极具特色的地理单元，有“世界屋脊”、“地球第三极”之称，农业生产区海拔跨度为 2 000～4 200 m，土壤因子以及温度、降雨、紫外辐射等气候因素会随海拔高度而改变，从而在高度梯度上形成复杂的生态环境，影响农作物和真菌的生长。已有研究初步表明，西藏粮油作物存在真菌毒素污染风险[4-6]，但目前对其深入、系统的研究较少。本研究拟以西藏青稞、小麦为研究对象，对其籽粒中多种毒素进行检测、分析，并对毒素阳性样品中污染真菌进行分离、鉴定，以期探明西藏青稞、小麦中污染真菌的种类和分布及其产毒类型，为西藏高原农作物的真菌毒素污染减控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为来自西藏4个地市11个县(区)2018年收获的青稞94份、小麦55份，共计149份。其中拉萨市达孜县5份，林周县6份，墨竹工卡县6份；林芝市察隅5份，波密县48份，巴宜区5份；昌都市卡若区52份，八宿县37份，左贡县34份，察雅县3份；阿里地区普兰县20份。

图1 采样点分布图

1.2 真菌毒素的测定

称取5 g样品(精确到 0.02 g)，加入 10 mL 水充分浸润后，再加入 10 mL 的 1∶9甲酸/乙腈，室温下150 r·min-1振荡提取1 h。加入QuEChERS盐包，8 800 r·min-1离心5 min；取 1 mL滤液直接加入SPE小柱，待流干后加入 0.5 mL 乙腈洗脱，吹干，收集全部流出液。用乙腈水溶液(1∶1)定容到1 mL，过 0.22 μm有机滤膜后，采用液相色谱-串联质谱法同时测定黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-AcDON)、杂色曲霉毒素(ST)、伏马毒素 B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、HT-2、T-2共15种毒素。色谱条件为：C18色谱柱，柱温为30 ℃，进样量为1 μL；流动相A为2 mol·L-1(含0.1%甲酸)乙酸铵，流动相B为甲醇。喷雾电压为5 500 V，鞘气为 60 psi，辅气为55 psi，离子源温度为550 ℃。

1.3 真菌的鉴定

形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》[7]。采用TIANGEN公司真菌基因组抽提试剂盒提取总 DNA。PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4。PCR反应体系(50 μL)：1.0 μLDNA模板，5.0 μL 10×Buffer，1.0 μLTaq聚合酶，1.0 μL dNTP，引物ITS1和ITS4各1.5 μL，39.0 μL ddH2O。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。取2 μL PCR 产物，用1%琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物送交上海桑尼生物科技有限公司测序，利用 BLAST 软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 供试材料中真菌毒素污染分布

149份供试样品中共有30份被检出真菌毒素(20.13%)，其中青稞样品16份(17.02%)，小麦样品14份(25.45%)。

在被测样品中存在OTA、ZEN、ST、15-DON、AFB2共5种毒素污染，检出率分别为 4.70%、4.70%、10.74%、0.67%、2.68%。以ST检出率最高，含量为3.28～109.5 μg·kg-1,平均含量为0.12 μg·kg-1。OTA阳性样品中，OTA含量为 0.89～429.10 μg·kg-1，依据GB 2761-2017标准，3.36%样品超出国家限量标准；ZEN阳性样品中的ZEN含量范围为6.94～ 543.40 μg·kg-1，超标率为1.34%；其他3种毒素因未有限量标准，暂不做判定。

青稞样品中，毒素总检出率为19.15%，毒素总超标率为5.32%；以OTA检出率最高(6.38%)，超标率为4.26%，最高含量为429.10 μg·kg-1；其次是ZEN，检出率为5.32%，超标率为1.06%，最高含量为543.40 μg·kg-1；第三是ST，检出率为4.26%，最高含量为54.47 μg·kg-1。小麦样品中，毒素总检出率为 25.45%，毒素总超标率为3.64%。以ST检出率最高，为21.82%，最高含量为109.50 μg·kg-1；其次是ZEN，检出率为3.64%，超标率为 1.82%，最高含量为182.70 μg·kg-1(表1)。

表1 青稞和大麦中的真菌毒素污染

2.2 供试材料中主要产毒真菌分布

于42份被真菌毒素污染的籽粒样品中共分离到199份真菌，分属23属67种，其中青霉属(Penicillium)20种，曲霉属(Aspergillus)7种，枝孢霉属(Cladosporium)5种，篮状菌属(Talaromyces)4种，毛壳属(Chaetomium)4种，毛霉属(Mucor)3种，镰孢属(Fusarium)3种，链格孢属(Alternaria)3种，节菱孢属(Arthrinium)2种，Dichotomopilus属2种，横梗霉属(Lichtheimia)2种，根霉属(Rhizopus)、枝顶孢霉属(Acremonium)、笋顶孢霉属(Acrostalagmus)、黑管菌属(Bjerkandera)、帚枝霉属(Sarocladium)、木霉(Trichoderma)、单端孢属(Trichothecium)、轮枝孢属(Verticillium)、附球菌属(Epicoccum)、派伦霉属(Peyronellaea)、Pleosporales属、Pseudogymnoascus属各1种。23属中，青霉属为优势属，占分离菌株总数的比例(占比)高达 48.74%；曲霉属次之，占18.09%；其他属的占比详见表2。

表2 产毒真菌种类及百分比

26份青稞样品中，共分离到119株真菌，分属18属48种。青霉属占比最高，为52.94%；曲霉属次之，占比为18.49%；毛壳属、附球菌属占比均为3.90%；枝孢霉属、根霉属占比均为 3.36%；节菱孢属、横梗霉属分离频度均为 2.52%；镰刀菌属、毛霉属属、篮状菌属、帚枝霉属占比均为1.68%；其他属占比和为0.82%。48种菌株中，P.granulatum占比最高，为 10.08%，P.chrysogenum占比为7.56%(表3)。

表3 青稞中产毒真菌种类及百分比

16份小麦样品中，共分离到80株真菌，分属14属33种。青霉属占比最高，为42.50%；曲霉属次之，占比为17.50%；枝孢霉属、帚枝霉属占比为均6.25%；链格孢属占比为5.00%；枝顶孢霉属、镰刀菌属、米根霉属、单端孢属占比均为 2.50%；其他属占比和为1.25%。48种菌株中，P.chrysogenum占比最高，为12.50%，其次为A.versicolor占比为10.00%，P.granulatum占比为7.50%(表4)。

表4 小麦中产毒真菌种类及百分比

3 讨 论

本研究对149份西藏青稞和小麦中的15种真菌毒素污染研究发现，毒素总检出率、总超标率为20.13%、6.00%，高于前期研究报道的 2.40%、0.93%[6]。Martina等[8]对捷克52个大麦及麦芽中17种真菌毒素污染的研究结果表明，所有样品都存在至少两种毒素的污染，且所有样品都受到恩镰孢菌素(Enniatins)污染，均未受到AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及OTA的污染；Alexandra[9]对捷克大麦中镰刀菌毒素的研究表明，83%的大麦均受到DON的污染。本研究表明，青稞污染多以单个真菌毒素污染为主，交叉污染占比仅为 2.13%，以OTA、ST污染相对较为严重；镰刀菌中以ZEN污染为主。这可能是由于西藏高海拔气候环境下菌群分布的差异导致真菌毒素种类有所不同。

研究表明，杂色曲霉毒素能诱发实验动物产生多种肿瘤，且与人类胃癌、肝癌的发生有一定的相关性[10-11]。欧洲食品安全局(EFSA)调查了来自9个欧洲国家400 份谷物样品，发现小麦、黑麦、大麦样品中ST污染率为2%～6%，平均含量低于1.5 μg·kg-1[12]。Kovalenko等[13]对俄罗斯 350份谷物样品中ST进行调查，发现小麦、玉米和大麦中的检出率分别为0～21%、5%～8%和1%～23%。国内研究者发现，我国粮食中杂色曲霉污染较为严重，上世纪九十年代末期，山东省小麦毒素污染率高达89.8%，大米毒素污染率为41.5%；浙江省大米污染率为17.5%[14-15]。20世纪初，田禾菁等[16]对中国东北、华东、华中、西南、西北共 12个省市的小麦、玉米和大米共 1 580份样品进行了检测，发现其杂色曲霉素平均污染量分别为68.9、32.2、13.9 μg·kg-1，污染率分别为98%、89%和 72%。本研究中，西藏地区小麦中杂色曲霉毒素检出率为21.82%，阳性样品中平均含量为17.94 μg·kg-1，检出率及平均含量虽低于上述报道，但鉴于ST的致癌性，对西藏的粮食安全及其人民的健康仍有一定的威胁。目前，我国暂时没有规定食品中杂色曲霉毒素的限量标准，建议相关部门加快制定杂色曲霉限量标准，以保障居民身体健康。

已有的研究表明，产OTA主要菌为赭曲霉、碳黑曲霉、疣孢青霉。部分报道洋葱曲霉(Aspergiliusalliaceu)、蜂蜜曲霉(Aspergiliusmelleus)、佩特曲霉(Aspergiliuspetrakii)、硫色曲霉(Aspergiliussulphureus)、(Aspergiliusalbertensis)金头曲霉(Aspergiliusauricomus)也能产OTA[17]。赭曲霉最佳生长温度为24 ℃～31 ℃，是在热带和亚热带地区OTA污染的主要产生菌；疣孢青霉最佳生长温度为20 ℃，0 ℃环境下也能生长，是加拿大和欧洲等寒冷地区OTA污染的主要产生菌[18]。西藏自治区海拔高，气候寒冷，年平均气温为 5 ～ 6 ℃，OTA在全区污染较为普遍，且被污染样品毒素含量较高，阳性样品中平均含量高达186.94 μg·kg-1，而在阳性样品中仅分离到疣孢青霉，因此，推测疣孢青霉能耐低温，且产OTA的能力较强。

链格孢菌能产生70多种有毒代谢物，且对人或动物危害较大，甚至某些链格孢毒素还有致畸、致癌、致突变作用[19]。国内外研究表明，链格孢毒素在麦类作物中污染较为普遍[20-22]。本研究中，我们分离到Alternariatenuissima、Alternariaalternata两种链格孢菌。因此，应加快链格孢毒素在高原农作物中的污染水平和菌群分布 研究。

镰刀菌可产生很多类型的毒素，如DON、ZEN、T-2毒素等。本研究发现，供试样品中镰刀菌毒素检出比例较高，但许多被镰刀菌毒素污染的样品却未分离到镰刀菌，究其原因：一是适应力较强的菌种过度生长繁殖，抑制相对生长缓慢的镰刀菌生长；二是由于环境的改变或其他原因，菌株在储藏过程中失活。如本研究一个阳性样品中ZEN含量高达366.72 μg·kg-1，但未从该样品中分离到镰刀菌，仅分离到白黄笋顶孢霉菌株，据报道该菌对镰刀菌有一定的抑制作用[23]，是否是其抑制镰刀菌生长有待于进一步研究。因此，深入探讨农作物固有的有益真菌与产毒真菌的竞争关系及机理可为高原真菌毒素绿色防控提供理论基础。