血小板微小RNA-223和微小RNA-21对冠心病患者经皮冠状动脉介入治疗后氯吡格雷抵抗的预测价值

郭玉梅 张琳 李海洲

P2Y12受体拮抗剂是目前临床上常见的抗血小板药物[1]，尤其以氯吡格雷的应用最广泛。氯吡格雷本身属于无活性的前体物质，需要经肝药酶代谢才能生成有抗血小板活性的硫醇代谢产物，通过与血小板P2Y12受体细胞外半胱氨酸相互作用，不可逆地阻断血小板表面二磷酸腺苷(ADP)与P2Y12受体结合，进而发挥抗血小板激活的作用[2]。阿司匹林联合氯吡格雷一直是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后双联抗血小板治疗的标准方案[3]，在临床上，虽然部分患者遵医嘱服用标准剂量氯吡格雷，但仍有4%～30%的患者发生氯吡格雷抵抗[4]，包括支架内血栓、再发急性心肌梗死、猝死等缺血事件。目前有研究证实，除了患者依从性和氯吡格雷代谢相关基因多态性因素外，血小板内特异性表达的微小RNA(miRNA，miR)也可能在血小板活化过程中发挥重要作用[6]。Landry等[7]发现miR-223通过调节P2Y12受体的表达降低血小板抑制率，而血小板抑制率降低后，又可反馈性抑制miR-223的分泌。有研究结果显示，miR-21可能与血小板聚集、血管内皮功能及氯吡格雷代谢有关[8]。因此，本研究主要探讨血小板miR-223和miR-21作为冠心病患者行PCI后抗血小板反应性生物标志物的可能性，旨在为筛选氯吡格雷抵抗的高危患者提供辅助参考指标，以尽快调整用药方案，尽量实现个体化治疗。

对象与方法

1.对象：2017年1月～2018年8月于我院行PCI的冠心病患者119例，其中男74例，女45例，年龄35～84岁，平均年龄(66.03±9.89)岁。排除标准：(1)合并本研究用药禁忌证；(2)PCI前行溶栓治疗；(3)既往曾接受过PCI；(4)血小板计数<125×109/L或>350×109/L；(5)PCI前1个月服用抗凝药物或其他抗血小板药物；(6)合并心肌病、恶性肿瘤、急慢性感染或活动性出血。根据血小板抑制率，将患者分为氯吡格雷反应正常组(正常组)67例(56.3%)和氯吡格雷抵抗组(抵抗组)52例(43.7%)。本研究经我院伦理委员审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)治疗方案：所有患者PCI前均口服负荷剂量氯吡格雷300 mg+阿司匹林肠溶片300 mg。术后继续遵医嘱口服阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg每天1次及他汀类药物等维持治疗。

(2)血小板抑制率检测：所有患者均于PCI后服用氯吡格雷48 h后采集空腹静脉血2 ml，置于枸橼酸钠真空采血管中，于2 h内采用TEG5000血栓弹力图凝血分析仪(美国Haemoscope公司)检测以花生四烯酸(AA)和ADP诱导的血小板抑制率，根据使用说明，若血小板抑制率<50%则定义为氯吡格雷抵抗；否则为氯吡格雷反应正常，其中氯吡格雷反应正常又分为氯吡格雷敏感(75%≤血小板抑制率≤100%，敏感组)和有效(50%≤血小板抑制率<75%，有效组)，氯吡格雷抵抗又分为氯吡格雷低反应(20%≤血小板抑制率<50%，低反应组)和无效(血小板抑制率<20%，无效组)[9]。

(3)血小板miR-223和miR-21水平检测：采集所有患者PCI后次日清晨空腹肘静脉血5 ml，1 500 r/min离心5 min，取血小板富集层，加入40 ml人CD45磁珠beads试剂重悬，采用磁性细胞分选系统收集血小板，采用流式细胞术检测血小板纯度。采用Trizol法(试剂盒购自美国Invitrogen公司)提取血小板总RNA，然后采用逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)和M-MLV逆转录酶(大连TaKaRa公司)进行逆转录，以cDNA为模板，加入miR-223和miR-21茎环引物(上海生工公司提供)和SYBR Green荧光染料(试剂盒购于大连TaKaRa公司)进行聚合酶联反应(PCR)，反应参数：95 ℃ 30 s预变性，45个循环(95 ℃ 5 s变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸45 s)。引物序列：miR-223(F：5’-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3’；R：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3’)；miR-21(F：5’-GTGTGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3’；R：5’- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3’)；U6(F：5’-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3’；R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)。收集荧光信号，以小分子U6作为内参。所有反应设置3个平行样本和无模板的阴性对照，以2-ΔΔCt表示目的miRNA的相对表达水平。

结果

1.两组患者临床资料比较:抵抗组患者WBC计数、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血小板miR-223、miR-21水平高于正常组，Hb低于正常组(P<0.05),两组其余指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的影响因素分析:以发生氯吡格雷抵抗作为因变量(氯吡格雷抵抗赋值1，氯吡格雷反应正常赋值0)，两组间比较差异有统计学意义的变量作为自变量，行多元logistic回归分析结果显示，血小板miR-223和miR-21水平升高是冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的独立危险因素(P<0.05)，而WBC计数、Hb、HDL-C不是其发生氯吡格雷抵抗的独立影响因素(P>0.05)。见表2。

表2 冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的影响因素分析

3.各亚组患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比较:各亚组患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)；且随着血小板抑制率降低，血小板miR-223和miR-21表达水平均逐渐升高，其中无效组患者最高，而敏感组患者最低(P<0.05)。见表3。

表3 各亚组患者血小板抑制率、miR-223及miR-21水平比较

4.行PCI的冠心病患者血小板miR-223、miR-21水平与血小板抑制率的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，行PCI的冠心病患者血小板miR-223和miR-21水平与血小板抑制率均呈负相关(分别为r=-0.384，P<0.001；r=-0.506，P<0.001)。

5.血小板miR-223和miR-21对冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的预测价值:血小板miR-223预测冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的ROC曲线下面积(AUC)为0.69(95%CI0.53～0.78)；血小板miR-21的AUC为0.64(95%CI0.51～0.69)；血小板miR-223联合miR-21的AUC为0.85(95%CI0.77～0.94)。血小板miR-223联合miR-21的预测价值高于血小板miR-223或miR-21单独的预测价值。见图1。

讨 论

血栓形成是导致冠心病并发症的重要病理因素之一，因此，抗血小板治疗是冠心病治疗尤其是预防PCI后血栓形成的重要基石。阿司匹林联合氯吡格雷双联抗血小板治疗是我国目前各指南推荐的标准方案，但由于冠心病病因复杂及患者个体化差异等因素影响，常无法兼顾疗效和出血风险。实现抗血栓治疗的最大获益除需要不断完善介入技术和医疗器械及辅以专业护理外，提前筛选发生氯吡格雷抵抗的高危患者，选择合理的个体化治疗方案，也是改善其预后的关键环节。

氯吡格雷属于二代噻吩砒啶类衍生物，通过不可逆地阻断ADP受体，抑制纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa受体结合，进而发挥抑制血小板聚集作用[10]。个体差异性是氯吡格雷发挥抗血小板作用过程中不可忽视的难点。Cori等[11]研究显示，约4%～30%的冠心病患者接受规范治疗后会发生氯吡格雷抵抗，大大增加临床血栓事件的发生风险。本研究中，119例冠心病患者行PCI后遵医嘱服用阿司匹林和氯吡格雷，其中52例患者血小板抑制率<50%，氯吡格雷抵抗的发生率为43.7%。近年来，考虑到比浊法的准确度和稳定性不高，我院逐渐采用床旁血栓弹力图检测仪代替比浊法用于血小板反应性检测。

除代谢相关基因多态性与氯吡格雷抵抗的发生相关外，循环miRNA亦可能与其相关，因此，有学者开始从循环miRNA角度寻找方便检测且有效预测发生氯吡格雷抵抗的生物标志物[12]，作为辅助预测因子，用于高危患者的筛选，以指导临床用药。虽然miRNA的表达谱和功能尚不明确，但因其具有结构稳定性和细胞、组织、疾病表达特异性，其作为疾病标志物的优势逐渐得到认可。人类血小板中存在大量稳定表达的miRNA，在血小板mRNA转录过程中起关键的调控作用[13]。如Kaudewitz等[14]发现血小板miR-223、miR-21可调节P2Y12受体mRNA表达，且与血小板反应性密切相关。孙垭娉等[15]研究发现，miR-223是外周血中血小板、微泡、单核细胞、巨核细胞中表达量最高的miRNA。很多研究证实miR-223不仅影响血小板生成，而且影响血小板功能，包括血小板表面抗原表达、粘附、聚集、活化等。miR-21同样在心血管疾病中发挥重要作用。Massimi等[16]的研究结果显示，miR-21通过Tropomyosin I介导血小板衍生因子-BB的分泌和功能，从而影响心肌缺血。且Barwari等[17]的研究结果显示，miR-21可影响血小板的数量、大小及功能。本研究中，抵抗组患者血小板miR-223、miR-21水平高于正常组，且随着血小板抑制率降低，血小板miR-223和miR-21表达水平均逐渐升高，其中氯吡格雷无效组最高，而氯吡格雷敏感组最低；多元logistic回归分析结果显示，血小板miR-223和miR-21水平升高是冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的独立危险因素；Pearson相关分析结果显示，行PCI的冠心病患者血小板miR-223和miR-21水平与血小板抑制率均呈负相关，表明血小板miR-223、miR-21与血小板的功能密切相关。在本研究中，ROC曲线分析结果显示，血小板miR-223和miR-21单独或联合预测冠心病患者PCI后发生氯吡格雷抵抗的AUC均较高，且二者联合的预测价值高于二者单独的预测价值。

综上所述，冠心病患者PCI后服用双联抗血小板治疗存在较大的个体差异性，其血小板miR-223和miR-21水平与血小板反应性呈明显负相关，抗血小板治疗前联合检测血小板miR-223和miR-21水平有助于筛选氯吡格雷抵抗的高危患者，在个体化抗血小板治疗方面具有一定的参考价值。