感染病原二代高通量基因测序技术诊断肾移植术后非HIV型肺孢子菌肺炎一例

周燕琳 陈亚娟

患者，女，27岁，因“咳嗽咳痰伴活动后气促半月，加重1周，发热3天”于2018年11月13日入院。患者入院半月前因受凉后出现咳嗽，干咳为主，偶咳白色黏痰，伴活动后气促，于门诊行胸部X线片检查结果示双肺中下野斑片状模糊影，考虑肺炎，予莫西沙星400 mg每日1次，治疗7天后复查胸部X线片，结果提示病变吸收不明显，予法罗培南0.2 mg每日3次治疗。病程中气促仍进行性加重，走平路100米感气促，使用莫西沙星、法罗培南疗效均欠佳。3天前出现发热，最高达38 ℃，伴畏寒。为求进一步治疗遂来我院。既往史：患者入院8个月前于我院诊断为慢性肾脏病5期，于2018年7月2日行同种异体肾移植术。现服用甲泼尼龙片8 mg每日1次、他克莫司3 mg每日3次、吗替麦考酚酯0.75 g每日3次治疗，未服用更昔洛韦预防性抗病毒治疗。患者系早产儿，出生体重约1.5 kg。有吸烟、饮酒史10年。有减肥药物(左旋肉碱)服用史，均因心悸、失眠等停药。入院体格检查：T 36.8 ℃，P 116次/分，R 27次/分，Bp 143/93 mmHg。心肺听诊未及明显异常，未见阳性体征。实验室检查：血气分析(未吸氧)：pH 7.33(7.35～7.45，括号内为正常值范围，以下相同)，PaO263 mmHg(80～100 mmHg)，PaCO229 mmHg(35～45 mmHg)。红细胞沉降率46 mm/h(2～26 mm/h)、C反应蛋白48.10 mg/L(<10.00 mg/L)、降钙素原0.09 ng/ml(<0.05 ng/ml)。结核菌素试验(PPD)、结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT)、(1-3)-β-D葡聚糖试验(G试验)、曲霉菌半乳甘露聚糖试验(GM试验)、呼吸道病原体九项检测(包括嗜肺军团菌、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流毒和副流感病毒的血清IgM抗体检测)、痰细菌及真菌培养、血培养结果均为阴性。痰涂片结果正常。巨细胞病毒(CMV)DNA定量<1.00×103IU/ml。抗核抗体、抗中性粒细胞胞浆抗体检查结果为阴性。胸部高分辨率CT(HRCT)检查结果示：双肺弥漫性对称分布磨玻璃密度影、马赛克表现，双肺下叶实变影，小叶间隔增厚，支气管血管束周围间质增厚，见图1。诊断为免疫损伤宿主肺炎，立即予以美罗培南1 g每8小时1次抗菌(覆盖普通细菌)、更昔洛韦125 mg每日2次抗病毒、卡泊芬净50 mg每日1次抗真菌(覆盖肺孢子菌)联合复方磺胺甲噁唑3片每日3次口服治疗。停用吗替麦考酚酯，下调他克莫司至2.5 mg每日3次、继续甲泼尼龙8 mg每日1次、地尔硫卓90 mg每日1次治疗。但患者仍有高热，呼吸困难进行性加重，多次行血气分析(面罩吸氧)提示PaO2<70 mmHg。2018年11月16日加大糖皮质激素剂量为甲泼尼龙40 mg每日1次静脉滴注抗炎治疗。患者未再发热，气促逐渐好转，于2018年11月21日复查胸部HRCT结果提示双下肺病灶增较前增多，见图2。遂于喉罩下行气管镜检查，肺泡灌洗液(BALF)细菌、真菌及结核培养、GM试验、结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测(gene-Xpert)结果均为阴性。双下肺病理检查结果：慢性炎症。感染病原二代高通量基因测序技术(mNGS)检测结果：肺孢子虫属(检出序列数：478 058)，耶氏肺孢子虫(检出序列数：475 485)。确诊为卡氏肺孢子菌肺炎(PJP)，停用美罗培南和更昔洛韦，继续卡泊芬净、复方磺胺噁唑治疗分别达到2周和3周疗程后停用。2018年11月23日调整甲泼尼龙为32 mg每日1次口服，每周减量8 mg至维持剂量8 mg，监测血肌酐水平稳定在150～170 μmol/L。2018年12月11日患者门诊复查胸部CT结果：双肺病灶较旧片明显吸收、好转，见图3。免疫抑制剂调整为原方案，即他克莫司3 mg每日3次及吗替麦考酚酯750 mg每日3次治疗。

讨 论

免疫损伤宿主肺炎已成为器官移植患者死亡的主要原因，因起病急、病情重，有创检查常难以进行，病原学诊断极为困难，往往需要多种抗菌药物联合治疗，覆盖细菌、真菌及巨细胞病毒等，甚至需要加用激素治疗[1]。本例患者初始予以经验性广谱抗生素治疗，症状有所缓解，但复查胸部HRCT提示肺部病灶增多，考虑可能合并其他罕见病原体感染。若为非感染性疾病，如免疫抑制剂诱发肺损伤、移植物抗宿主病引起的闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎等，激素治疗有效[2-3]。mNGS能一次并行对几十万甚至几百万条DNA分子进行序列测定，全面分析一个物种的基因组和转录组，目前已逐渐推广到临床应用，包括肿瘤性疾病、遗传学、微生物等方面的基因检测，协助诊断及治疗[4]。本例患者BALF经mNGS检测，最终得到病原学诊断，得以精准治疗。非HIV型PJP不同于HIV型PJP，前者急性起病且进展快、病情重，病原学诊断困难，预后极差，病死率高[5]。因肺孢子菌负荷量低，普通检查往往难以诊断,近年来有关文献报道聚合酶链反应(PCR)技术(包括普通、巢式及实时定量PCR)逐渐应用于PJP诊断，其敏感性及特异性均较高[6]。而mNGS亦能从痰液或BALF甚至血液标本中成功检出肺孢子菌，且能一次性检测出标本的所有病原体。mNGS与PCR技术对PJP诊断的特异性及敏感性比较需进一步研究。

此外，近期一项纳入561例感染或高度怀疑为感染患者的回顾性研究中，将血液、痰、BALF或组织匀浆行临床微生物、mNGS检测，与传统微生物培养相比，mNGS敏感度和特异度分别为50.7%比35.2%(P<0.01)、85.7%比89.1%(P=0.39),在检测前已使用抗生素的患者中，mNGS的阳性率更高(52.7%比34.4%)，且对不同标本的敏感性无差异[7]。在73例诊断不明的患者中，检测出卡氏肺孢子菌、衣原体、汉氏巴尔通体、诺卡菌、隐球菌、毛霉菌微孢子等罕见病原体，24例患者中检测出27种病毒，经验性治疗并未覆盖上述病原体，抗生素滥用问题严重。在Parize等[8]关于免疫抑制患者感染的双盲多中心前瞻性研究中，mNGS与临床微生物方法(包括涂片、培养、抗原检测、PCR技术等)相比，检测出病原体数量是后者的3倍左右(36%比11%),且mNGS有更高的阴性预测值(96.3%)。mNGS在死菌、使用抗生素的细菌、罕见、不典型及未知病原体、复杂混合感染中优势明显，还可同时检出病原体类型、毒力及耐药基因，具有灵敏、快速、低成本的特点[9]，不仅为临床提供诊断和治疗依据，还为微生物培养条件提供参考。

综上，如本例患者若能尽早获取标本通过mNGS检测结果，精准治疗，早期停用不必要抗生素，可降低医疗成本，并减少耐药菌产生。对于免疫抑制状态、反复住院的重症感染患者需尽快明确其病原体类型，疑似罕见及非典型病原体、病因不明、诊断困难或为复杂混合感染、传统微生物方法检测结果反复阴性且疗效欠佳等情况，推荐应用mNGS协助诊断。