一株耐铜真菌HLKF-11的初步鉴定及铜富集能力测定

王黎明，刘作林，梅 林

(1.湖北环境修复与治理技术研究有限公司，湖北 黄石 435003；2.湖北理工学院，湖北 黄石 435003)

铜是一种生命必需的微量元素，但过量的铜会危害人和动物的健康。铜矿开采、炼铜、镀铜等过程产生的“三废”和铜制剂、含铜农药的大量使用，给矿业废弃地及周边土壤造成严重的铜污染，并通过食物链危害人体健康。研究开发科学、经济、有效的治理方法，是铜污染土壤修复领域关注的热点。研究人员先后开发了物理修复和化学修复方法，如客土换土法、离子交换法、活性炭吸附法、化学沉淀法、电化学法和淋滤法等，这些方法能够在较短时间内去除土壤中的铜，具有一定的应用效果，但存在投入较大、对环境扰动大、易造成二次污染以及难于开展大规模工程治理等不足[1]。近年来，以植物、动物及微生物为主体的生物修复技术因其成本较低、无二次污染和效果持久等优势，受到全球的普遍关注，被列为未来最有前途的重金属污染治理技术[2]。

研究表明，铜矿区、铜污染土壤以及冶金和含铜化工厂排放污水中存在大量耐铜微生物，包括细菌、真菌、放线菌等[3]。傅冬和等[4]从养猪场周边土壤中分离出1株耐铜真菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，最高耐受铜浓度为940 mg·L-1，该菌对茶园土壤中的铜有一定的富集作用。张小菲等[5]从铜污染土壤中分离出1株耐铜节杆菌属细菌，该菌在pH值5.0、30 ℃时处理低浓度铜污染废水50 min，Cu2+吸附率达99.1%。柴新义等[6]从铜矿厂区土壤中筛选出1株高耐铜菌株，耐受铜浓度高达15 000 mg·L-1，经驯化培养后其最高耐受铜浓度可达54 300 mg·L-1，该菌对Cu2+表现出极高的耐受性和吸附能力，成为微生物治理重金属污染水体的优良备选菌种。董新娇[7]从电镀厂废水中分离出1株耐铜菌株，经鉴定为枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)，其最高耐受铜浓度可达720 mg·L-1。上述研究表明，由于长期的环境胁迫和自然选择，铜污染环境中存在大量的耐铜微生物，通过分离筛选和胁迫培养，能够获得有效治理铜污染土壤的微生物资源。

铜绿山铜铁矿是我国重要的铜矿开采、冶炼基地，长期的矿冶活动给当地的土壤造成了严重的铜污染。作者从铜绿山铜铁矿废弃露采场土壤中分离出1株耐铜真菌菌株HLKF-11，对其进行形态学鉴定和培养条件优化，并在最适培养条件下探讨菌株对铜的富集能力，为该菌株在铜污染土壤的生物修复中的应用奠定基础。

1 实验

1.1 土样的采集与处理

土样采自湖北大冶铜绿山铜铁矿废弃露采场南坑，剖面深度0～20 cm，以5 cm为1个梯度，用梅花五点法分别采集不同土壤剖面的土样，置于干净的装样瓶中，贴好标签带回实验室，置于4 ℃冰箱保存。

将不同土壤剖面土样混合均匀，烘干，磨细过 80目筛。称取1.0 g土样，置于100 mL烧杯中，加入浓盐酸和浓硝酸的混合液(3∶1，体积比)10 mL，置于消解炉上至完全消解。冷却后用2%稀硝酸溶液定容至100 mL，用原子吸收光谱法(Varian AA240型原子吸收光谱仪)测定样品铜含量，并计算土壤铜含量。

1.2 土样稀释液的制备

准确称取10 g土样放入锥形瓶中，加入100 mL无菌水充分混合，置于恒温摇床中，30 ℃、120 r·min-1下振荡15 min，使土样均匀分散，得到土样母液。取1 mL土样母液上清液于试管中，加入9 mL无菌水混合后得到混合液A(10-1)；接着取1 mL混合液A于另一试管中，加入9 mL无菌水混合得到混合液B(10-2)；以此类推，将土样上清液逐步稀释，依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同浓度的土样稀释液。

1.3 耐铜真菌筛选培养基的制备

以马丁培养基为基本培养基、CuSO4为筛选剂，制备耐铜真菌筛选培养基。具体方法是：按马丁培养基的成分与用量称取各组分，分别溶解于水中，每1 000 mL培养基添加3 mL孟加拉红溶液，添加500 mg·L-1CuSO4溶液，待所有成分均溶解后，添加自来水至所需体积，调节溶液pH值；溶液混合均匀后加入琼脂煮沸融化，装瓶后灭菌；待培养基冷却至45 ℃左右时，加入适量经抽滤除菌的链霉素溶液振荡混匀，倒平板冷却凝固后备用。

1.4 耐铜真菌的分离、筛选

用涂布法将不同浓度土样稀释液分别涂布于耐铜真菌筛选培养基上，3次重复，28 ℃恒温培养，每日观察；挑取单菌落，分别转接于新的平板中，经多次转接、分离，最后得到1株耐铜真菌菌株HLKF-11。

1.5 菌株的形态学观察

显微镜下观察菌落形态、菌丝形态以及孢子形态等，做好记录和拍照，并依据《真菌鉴定手册》[8]鉴定菌株。

1.6 菌株培养条件的优化

分别选择pH值、温度、碳源、氮源等进行单因素实验，优化菌株HLKF-11的培养条件。

1.7 菌株对铜富集能力的测定

采用振荡培养法。分别配制铜浓度(mg·L-1)为100、200、300、400、500、600、700的马丁液体培养基，接种菌株HLKF-11的孢子液，在最适培养条件下160 r·min-1振荡培养，每隔24 h取样一次，用原子吸收光谱法测定培养液上清液和菌丝(80 ℃烘干)的铜含量。3次重复，以不加铜为对照。按下式计算上清液和菌丝的铜含量：

上清液铜含量(mg·L-1)=L×50×250/50=250×L

(1)

菌丝铜含量(mg·g-1)=L×50×10-3/M=0.05×L/M

(2)

式中：L为测定的铜含量；M为菌丝质量。

2 结果与讨论

2.1 土样的铜含量(表1)

表1 土样的铜含量/(mg·kg-1)

由表1可知，土样的铜含量较高，为1 154.7～3 393.0 mg·kg-1，平均铜含量为2 536.8 mg·kg-1，达到重度污染水平。研究表明，在一些重金属含量高的采矿废弃地，由于长期的重金属胁迫选择，一些对重金属耐性强的植物、微生物在土壤中存活下来，表现出对重金属的超富集特性[9]。康薇等[10]曾在此区域筛选到1株耐铜的芽孢杆菌TLSB2-K，其对Cu2+具有较强的富集能力。因此，选择从矿业废弃地土壤分离筛选重金属耐性微生物成功率较高。

2.2 菌株HLKF-11的形态学鉴定(表2)

表2 菌株HLKF-11的形态特征

分析菌株HLKF-11的形态特征，参考《真菌鉴定手册》[8]，初步确定菌株HLKF-11为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

2.3 菌株HLKF-11培养条件的优化

研究pH值、温度、碳源、氮源对菌株HLKF-11生长的影响，以培养96 h后平板上菌落直径评价菌株的生长情况，结果见表3。

由表3可知，pH值为6.00～8.00时，菌落直径都较大，其中以pH值6.50最为合适，菌落直径达到8.85 cm；温度在24～28 ℃范围内，菌株生长较好，其中以28 ℃时最为合适，菌落直径达到9.24 cm；以蔗糖为碳源时，菌株生长最好，菌落直径为8.32 cm；分别以硝酸铵、硝酸钾和硫酸铵为氮源时，菌株均生长较好，其中硝酸铵为氮源时，菌株生长最好，菌落直径达到8.65 cm。综上，菌株HLKF-11的最适培养条件为：pH值6.50、温度28 ℃、蔗糖为碳源、硝酸铵为氮源。

表3 pH值、温度、碳源、氮源对菌株HLKF-11生长的影响

2.4 菌株HLKF-11对铜的富集能力

菌株HLKF-11对铜的富集量与培养液Cu2+初始浓度和培养时间密切相关。培养液Cu2+初始浓度、培养时间对菌株HLKF-11富集Cu2+量的影响见图1。

图1 培养液Cu2+初始浓度、培养时间对菌株HLKF-11富集Cu2+量的影响

由图1可知，培养液Cu2+初始浓度在100～700 mg·L-1范围内，培养4 d内，随着Cu2+初始浓度的增加，菌株对Cu2+富集量基本呈上升趋势；Cu2+初始浓度不同时，菌株对Cu2+最大富集量存在差异，Cu2+初始浓度为500 mg·L-1时，富集量最大，达到41.69 mg·g-1，明显高于Cu2+初始浓度为600 mg·L-1和700 mg·L-1时的最大富集量(分别为17.2 mg·g-1和22.97 mg·g-1);培养4 d后，随着培养时间的延长，菌株对Cu2+富集量整体呈下降趋势，至第6 d时趋于稳定。菌株HLKF-11对Cu2+富集量呈先升高后降低的可能原因是，随着培养时间的延长，菌株对Cu2+的解吸速率大于吸附速率，富集量下降[11]。这表明，菌株HLKF-11 对Cu2+的富集是一个动态平衡过程，可以通过调控培养液Cu2+的初始浓度、培养时间优化富集条件，获得最优的富集效果。

3 结论

以马丁培养基为基本培养基、CuSO4为筛选剂，从大冶铜绿山铜铁矿废弃露采场土壤中分离得到1株耐铜真菌菌株HLKF-11，经形态学观察，初步鉴定其为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。菌株HLKF-11以蔗糖为碳源、硝酸铵为氮源，在pH值为6.50、温度为28 ℃时，生长最好。在培养液Cu2+初始浓度为100～700 mg·L-1时，菌株HLKF-11都能生长并富集Cu2+，其中以培养液Cu2+初始浓度为500 mg·L-1时，Cu2+富集量最大，达到41.69 mg·g-1。表明菌株HLKF-11对环境中的Cu2+具有较高的富集能力和耐受能力。该研究对进一步丰富耐铜微生物资源以及应用于铜污染土壤的生物修复具有一定的理论和实践意义。