MRSA耐药性检测及SCCmec基因分型分析

屠雷钧 叶永志 林 娅 边保华

自1961年英国学者Jevons首先发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），随后在世界各国陆续发现，已成为医院内感染的重要病原菌之一［1-3］。2012年中国医院细菌监测网监测结果显示，在我国MRSA感染在SA中所占比例达47.9%［4］。MRSA具有致病力强、传播速度快、耐药性强、耐药谱广的特点，对人类健康构成严重威胁，其造成的感染与乙型肝炎、艾滋病并列成为世界三大难解决的感染性疾病之一［5］。MRSA的耐药主要是因为葡萄球菌染色体mec基因盒（CSSmec）中携带甲氧西林耐药决定子A（mecA）。且SCCmec型别较多，不同地区MRSA的SCCmec流行型别不同，其耐药特性也有所不同。为了解本院住院患者MRSA感染、SCCmec流行型别及耐药特征，将临床住院患者各类标本中分离的金黄色葡萄球菌（SA）作MRSA检测、基因分型及耐药性分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 157株SA为台州市中西医结合医院2018年1月至12月住院患者痰液、脓汁、血液、尿液等各种标本分离所得，排除同一部位重复的菌株。

1.2 质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC43300（MRSA菌株）、金黄色葡萄球菌ATCC25923（MSSA菌株）均购自中国菌种保藏中心。

1.3 主要试剂与仪器 血平板、MH平板、5%羊血哥伦比亚琼脂平板、MH肉汤等均为杭州天和微生物试剂公司产品；各种药敏纸片均为英国Oxoid产品；细菌基因组提取试剂盒为上海生工生物工程（股份）有限公司产品；VITEK-2Compact全自动微生物分析仪和革兰阳性细菌鉴定片为法国梅里埃公司产品；PCR扩增仪BIO-RAD S1000 Thermal cycle、凝胶电泳仪和成像系统均为美国BIO-RAD公司产品。

1.4 方法 （1）SA的培养与鉴定：以《全国临床检验操作规程》为标准进行分离培养［6］，并经法国梅里埃VITEK-2Compact型全自动细菌分析仪进行鉴定。（2）MRSA表型检测：采用头孢西丁琼脂扩散法，操作方法及结果判断按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的标准［7］。以金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌ATCC43300作质控。（3）MRSA基因检测：①MRSA基因组DNA提取：采用上海生工生物工程（股份）有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA。严格按试剂盒说明书操作。提取液质量的检测用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。②mecA及SCCmec基因分型检测：引物设计：mecA及SCCmec基因扩增引物委托上海生工生物工程（股份）有限公司合成。见表1和表2。聚合酶链反应（PCR）扩增体系及条件：PCR扩增总体系均为50μl：dNTPs混合液（2.5mmol/L）4μl，10× 缓冲液 5μl，上下游引物（25μmmol/L）各1μl，Taq酶0.5μl，镁离子0.5μl，DNA模板1μl，双蒸馏水补足至50μl。扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性 60s，55℃退火 60s，72℃延伸 60s，循环35个周期，最后72℃延长至10min。取PCR产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色紫外灯下成像，观察分析结果。

表1 PCR扩增mecA基因引物序列

表2 PCR扩增SCCmec基因引物序列

1.5 基因测序及分析 将PCR产物送上海生工生物工程（股份）有限公司纯化测序。测序结果经Gen Bank序列数据库中采用BLAST程序进行核苷酸序列比对，确定基因型。

1.6 药敏试验 采用K-B纸片扩散法，以CLSI标准进行操作和结果判断［7］，采用金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌ATCC43300作质控菌株。

2 结果

2.1 MRSA菌株表型检测结果 157株分离自临床各类标本的SA经表型检测有76株阳性，初筛阳性率为48.41%。

2.2 MRSA菌株基因检测及SCCmec分型结果 76初筛阳性的菌株，再经PCR检测mesA基因，电泳结果在147bp处有73株出现DNA阳性条带，MRSA确证试验阳性率为46.50%。PCR电泳结果见图1。73株确证为MRSA菌株经PCR检测SCCmec基因型，结果在280bp处出现41条DNA阳性条带，在398bp处出现27条DNA阳性条带，在200bp处出现2条DNA阳性条带，尚有3株无法分型。PCR电泳结果见图2。

图1 mecA基因PCR扩增电泳图

图2 SCCmec分型PCR基因扩增电泳图

2.3 基因序列测序结果 PCR阳性产物经纯化测序，并与Gen Bank序列数据库提供的SCCmec序列比对，结果确定200bp处阳性条带为SCCmecⅣ型，280bp处为SCCmec型，398bp处为SCCmecⅡ型。

2.4 药敏试验结果 SCCmecⅡ型与Ⅲ型对万古霉素、替考拉宁具有极高敏感性，相反对β-内酰胺类抗菌药物100%耐药，对其他常用抗菌药物也有较高耐药性，但SCCmecⅡ菌株耐药率显著低于SCCmecⅢ菌株，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 主要MRSA菌株不同SCCmec基因型的耐药结果（%）

3 讨论

MRSA具有较强的致病力，且具有多重耐药性的特点，备受临床医师高度关注。本资料结果显示，MRSA表型检测有76株阳性，初筛阳性率48.41%。由于MRSA产生的耐药是因MRSA获得mesA基因，mecA基因能编码产生新的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），造成对β-内酰胺类药物耐药，CLSI明确指出一旦在金黄色葡萄球菌中检测到mecA基因，即可认定MRSA［8］。据此，采用PCR技术将76株表型阳性菌株经mecA特异性检测，结果有73株PCR反应扩增到147bpDNA片段，MRSA确证阳性率为46.50%，该结果与2012年中国细菌耐药性监测网所监测的全国MRSA平均检出率47.9%基本相一致［5］，高于应建飞报道的37.28%［9］，表型与基因型检测符合率为96.05%。另3株表型检测虽然阳性，能表达β-内酰胺酶，但菌株未携带mecA基因，其原因据学者报道认为一旦SA细胞壁增厚变粗也能导致表型阳性而对β-内酰胺类药物耐药［10］。

SCCmec是一个能移动的遗传基因元件，由mecA等多种基因构成，还携带有多种质粒和转座子，编码除对β-内酰胺类药物耐药外，还能编码产生对多种抗菌药物耐药。依据SCCmec盒上基因复合体的组成不同，SCCmec有多种型别，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型主要见于医院感染获得性MRSA（HA-MRSA），SCCmecⅣ、Ⅴ型主要见于社区获得性MRSA（CAMRSA）。这几年又陆续发现其他新的型别SCCmec。SCCmecⅠ型是最早发现，所带耐药基因少，大多数对非β-内酰胺类药物敏感。SCCmecⅡ、Ⅲ型含耐药基因比Ⅰ型要多，且多种耐药基因整合在一起，表现为对多种抗菌药物耐药。相对SCCmecⅢ型要比Ⅱ型携带耐药基因更多，故其耐药性更强更广些。SCCmecⅣ、Ⅴ型分子较小，且基因较稳定，仅携带mecA基因，不带有其他耐药基因［11］，因此，对非β-内酰胺抗生素大多敏感。不同型别SCCmec在不同国家和不同地区流行也不相同，亚洲地区MRSA流行型别以SCCmecⅡ型为主，在我国南北地区流行菌株的基因型也有差异，北方对SCCmecⅡ型为主，而南方则以SCCmecⅢ型为主［12］。本资料结果显示，本组MRSA流行菌株主要是SCCmecⅢ型，由于SCCmecⅢ型携带有更多的耐药基因整合在一起，还可通过质粒等途径在葡萄球菌间传播而造成多重耐药，应引起临床医师高度关注。

SCCmecⅡ型与Ⅲ型对万古霉素、替考拉宁具有极高敏感性，未见耐药菌株，对β-内酰胺类药物100%耐药，对其他抗菌药物也有较高耐药性，但SCCmecⅡ型菌株对氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类和林可霉素类的耐药性显著低于SCCmecⅢ型菌株。表明SCCmecⅢ型菌株比Ⅱ型菌株携带有更多的耐药基因整合在一起，且mecA基因与其耐药基因紧密相邻而连锁，造成更为严重耐药。利奈唑胺对MRSA具有很高敏感性，极少见到耐药报道，但在本资料中尚有1株SCCmecⅢ型菌株产生耐药，据报道可能与23S核糖体RNA 突变或cfr基因介导的2503位腺嘌呤甲基化有关［13］，有待今后工作中进一步加以研究。

了解MRSA在临床感染率及SCCmec基因型在当地的流行情况，对防控MRSA菌株在院内流行及耐药性分析具有重要意义。