姜黄素壳聚糖微球治疗大鼠溃疡性结肠炎

熊骏 廖鹏 吴映霖 游宇 黄媛华 黄国栋 余淑娇

(1南昌大学医学院，江西 南昌 330006；南昌大学第一附属医院 2中西医结合科；3麻醉科；4消化科；5湖南中医药大学附属衡阳医院肛肠科；6南昌大学第一附属医院风湿免疫科)

溃疡性结肠炎多表现为反复出现的腹痛、腹泻、黏液脓血便，是一种慢性非特异性炎症性疾病。在发病时多伴有部分肠外症状和全身症状。其特异性致病因素及发病机制尚不十分清楚，目前普遍认为，炎症因子和抗炎因子的失衡导致溃疡性结肠炎的发生。免疫异常是本病的重要因素，可能涉及多种细胞因子。当免疫功能正常时，许多细胞因子的分泌和活性处于动态平衡状态〔1～5〕。研究认为溃疡性结肠炎发病时，机体内各种细胞因子之间相互作用，促炎与抗炎细胞因子失衡，导致黏膜损伤〔6～8〕。研究中发现，白细胞介素(IL)-1β、IL-4和IL-6与溃疡性结肠炎密切相关，同时这些细胞因子表达水平与核转录因子(NF)-κВ的激活密切相关〔9，10〕。本研究旨在探讨姜黄素壳聚糖微球对溃疡性结肠炎的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性BALB/c大鼠120只，体重180～210 g，由长沙市开福区东创实验动物部提供(SCXK湘2009-0012)，常规饲料喂养，喂养水为纯净水。

1.2药物与试剂 5%葡聚糖硫酸钠(DSS)购自北京诺特莱斯生物科技有限公司；大鼠抗人NF-κВ单克隆抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6002)购自北京中杉金桥生物工程有限公司；IL-1β、IL-4、IL-6购自欣博康生物科技有限公司；美沙拉嗪肠溶片购自佳木斯鹿灵制药有限责任公司(生产批号：H19980148)；姜黄素购自西安应化生物技术有限公司(生产批号：20100220)。

1.3造模方法 大鼠溃疡性结肠炎模型采用5%DSS建立〔11〕：随机取BALB/c大鼠100只，自由饮用5%DSS水溶液，同时分别灌胃给予干预药物，0.2 ml/(10 g·体重)，1次/d，连续7 d后再饮用不含DSS的蒸馏水14 d。

1.4动物分组及药物治疗 将未经任何处理的20只大鼠设为空白对照组，正常饮水、饮食。将100只溃疡性结肠炎大鼠随机分为5组各20只。模型组：5%DSS自由饮水，正常饮食；阳性对照组：5%DSS自由饮水+含5 g/L柳氮磺胺吡啶的饲料喂养；壳聚糖微球组：5%DSS自由饮水+含15 g/L壳聚糖微球的饲料喂养；姜黄素组：5%DSS自由饮水+含20 g/L姜黄素的饲料喂养；姜黄素壳聚糖微球组：5%DSS自由饮水+含20 g/L姜黄素壳聚糖微球的饲料喂养。所有大鼠给药4 w。

1.5标本采集 给药4 w后股静脉采血2 ml，取肛门上8 cm处的结肠组织用于检测，治疗结束后采用颈椎脱臼法处死。

1.6病理及免疫组化检测 组织学损伤评分：参考Dieleman等〔10〕制定的标准，以结肠黏膜损伤点的长度作为结肠损伤分数方法。1分：≤0.5 mm；2分：>0.5 mm且≤1.0 mm；3分：>1.0 mm且≤2.0 mm；以此类推，损伤点宽度>2.0 mm时，分数加倍。疾病活动指数评分：参照Murano等〔12〕建立评估标准，每日监测体重、大便性状及便血情况(采用联苯胺法测定)。疾病活动指数(DIA)评分标准：体重无下降，粪便性状正常，便检隐血(-)计0分；体重下降>0且<5%，粪便性状半稀，便检隐血(+)计1分；体重下降≥5%且<10%，粪便性状半稀，便检隐血(+)计2分；体重下降≥10%且<15%，粪便性状半稀，便检隐血(+)计3分；体重下降≥15%，粪便性状稀便，肉眼血便计4分。病理学检测：剪取病变最明显处结肠组织，常规病理切片并摄像，并对结肠标本行苏木素-伊红(HE)染色。免疫组化检测：剪取距离肛门8～10 cm处的大鼠结肠组织用冷生理盐水反复冲洗干净，剪取肉眼所能看见的病变最明显的一段溃疡结肠黏膜，浸入4℃预冷的2.5%戊二醛进行前固定，再经1%锇酸后固定，制备4 μm厚石蜡连续切片，待免疫组化检测肠黏膜NF-κB表达，具体按MaxVisionTM试剂盒说明书进行。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-1β、IL-6和IL-4的表达。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1病理结果 模型组结肠黏膜遭严重破坏，部分有缺损，黏膜内腺体排列紊乱、变形。姜黄素壳聚糖微球组及姜黄素组病变较轻，黏膜较为完整。空白对照组结肠组织结构规则，腺体排列整齐。见图1。

图1 各组结肠组织病理(HE染色，×100)

2.2各组结肠损伤评分比较 治疗4 w后，模型组、阳性对照组、壳聚糖微球组、姜黄素壳聚糖微球组和姜黄素组均表现为溃疡形成，模型组损伤评分最高。姜黄素壳聚糖微球组与其他组相比，结肠黏膜组织学损伤评分显著降低(P<0.01)。治疗4 w后，模型组、壳聚糖微球组、姜黄素壳聚糖微球组和姜黄素组均表现为不同程度体重下降、便稀、便血，模型组疾病活动指数评分最高；姜黄素壳聚糖微球组与其他各组比较差异显著(P<0.01)。见表1。

表1 各组结肠损伤及疾病活动指数评分比较分)

2.3各组NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比较 经4 w治疗，姜黄素组和姜黄素壳聚糖微球组IL-4水平明显高于模型组和阳性对照组(P<0.01)，而IL-1β、IL-6、NF-κB水平明显低于模型组和阳性对照组(P<0.01)；姜黄素壳聚糖微球组与姜黄素组相比，血清IL-1β、IL-6、NF-κB含量明显降低(P<0.01)，IL-4含量显著升高(P<0.01)，见表2。

表2 治疗后各组NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比较

3 讨 论

姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质，在传统的中药理论中具有抗炎、止痛，活血化瘀的功效，现代医药还发现姜黄素具有抗氧化、降血脂、抗凝、抗肿瘤及清除氧自由基等作用。研究表明，姜黄素具有抗炎症性肠病的作用〔5～7〕。但由于姜黄素稳定性较差，在水中不易溶解，且体内代谢半衰期较短，故不易制备成片剂、胶囊剂或注射剂等剂型，大大限制了其临床应用。

药物缓释体系是近年来药物研究最热门的领域之一。在药物控释技术方面，需要药物分子与药物载体按照一定的物理或化学方式相结合，通过特殊的药物制剂工艺和技术，使药物按要求释放以达到更好的治疗效果。实现药物的装载方式主要有物理吸附、物理包封、化学耦联〔8,9〕。物理包封过程中，载体的交联程度是影响药物释放的关键因素之一。目前研究较多的是可降解微球和水凝胶两种载药方式〔10,11〕。微球是指用高分子生物材料将药物包裹形成的直径为几微米到几百微米的微小球状实体。交联度不同的载药微球，药物的释放率有所差异，这表现在交联度高的微球载体表现为延时缓释，而交联度低的表现为暴释。同一种药物装载于不同的载体，由于载体结构间的差异，与药物间的作用方式的不同，会影响药物的缓释能力及药物作用于病灶的功效。与此同时单纯的壳聚糖微球在溃疡性结肠炎的治疗中也起到了一定的抑制炎症反应的作用，有相关文献也表明，壳聚糖对结肠炎的改善作用可能是通过抑制 NF-κB 通路减少炎性细胞因子的释放起作用〔13〕，因此，用壳聚糖微球制成的姜黄素壳聚糖在治疗溃疡性结肠炎方面效果更好，其作用机制可能是姜黄素壳聚糖微球通过抑制NF-κВ的表达，减轻炎症反应，通过抗炎作用达到减轻溃疡性结肠炎中结肠组织损伤的效果。