当归红芪超滤物对辐射致新生大鼠心肌细胞氧化应激和炎性因子的影响

刘旭帮 张朝华 孙丹丹 赵信科

(1郑州人民医院心血管内科，河南 郑州 450000，2甘肃中医药大学附属医院心血管内科)

放射性心脏疾病一般是指心脏受到放射性物质辐射后而发生的一类损伤性病变，随着放射性治疗在恶性肿瘤中的广泛应用，放射性心脏疾病的临床报告逐渐增多，患者主要临床表现为心律失常、心包炎、心肌纤维化及心肌梗死等，目前仍无有效的治疗手段，给患者的身心健康造成极大影响〔1,2〕。随着中医临床研究的不断发展，研究发现当归、红芪等中药具有抗氧化损伤及抗辐射等作用〔3,4〕，本研究通过观察当归红芪超滤物对辐射后乳鼠心肌组织氧化应激和炎性因子相关指标的影响，为放射性心脏疾病的发生机制及中医治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 选择1～3日龄的Wistar大鼠10只作为实验动物，雌雄不限，体重6～10 g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2实验药物 当归红芪超滤物的制备过程〔5〕：当归和红芪饮片按照1∶5的比例进行混合，水煎煮3次后，过滤杂质并加热浓缩，冷却至室温后使用陶瓷膜微滤当归红芪水煎剂浓缩液，具体技术参数：压力0.5 kPa/m3、温度25 ℃、流量100 L/(h·m3)，选用截留相对分子量为1×105PNA的中空纤维超滤膜对微滤后的浓缩液进行超滤处理，具体技术参数：膜面积0.25 m2、系统压力≤5.0 bar、过滤能力 2～30 L/h，最后将浓缩超滤液喷雾干燥成粉末，分装置于干燥器中备用。

1.2实验方法

1.2.1心肌细胞原代培养 无菌条件下取Wistar大鼠心尖部组织，使用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，将心肌组织剪成约1 mm3大小后移入离心管中，加入0.08%胰蛋白液进行反复吹打，动作要轻柔，然后置于37℃水浴消化10 min，弃去上清液，再加入0.08%胰蛋白液和0.05%胶原酶，反复吹打后置于37℃水浴消化8 min，取上清液移入新离心管中，加入等体积含15%新生牛血清的DMEM培养液终止消化，将混合液以1 500 r/min离心10 min后弃去上清液，加入培养液混悬细胞沉淀，放置于37℃ 5%CO2培养箱中进行细胞培养。

1.2.2实验分组 空白组常规细胞培养48 h后换液，继续培养24 h；模型组常规细胞培养48 h后换液，采用6 MV-X线垂直照射，放射野为30 cm×30 cm，靶区照射剂量DT为200 cGy，以6 Gy作用心肌细胞，继续培养24 h；干预组根据当归红芪超滤物浓度的不同，分别加入含3 mg/ml(低剂量干预组)、6 mg/ml(中剂量干预组)和9 mg/ml(高剂量干预组)当归红芪超滤物至培养基中，培养48 h后换液，采用同模型组相同的X线进行照射，使用加入上述浓度当归红芪超滤物的培养基继续培养24 h。

1.3观察指标

1.3.1细胞活性检测 将心肌细胞以1×105个/ml接种于96孔培养板中，100 μl/孔，各组经过相应处理后，每孔加入100 μl 噻唑蓝(MTT)于37 ℃孵育4 h后，弃去培养液，然后每孔再加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分振荡使结晶物溶解。选择570 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算生长抑制率 =(空白组 OD值-待检测组OD值)/ 空白组OD值 ×100%

1.3.2氧化应激指标检测 各组心肌细胞经过相应处理后，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)含量，硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量，2,4-二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)含量，均严格按照试剂盒说明书进行操作，并通过分光光度计比色法进行检测。

1.3.3炎性因子指标检测 各组心肌细胞经过相应处理后，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞生长抑制率的影响 模型组OD值显著低于空白组(P<0.05)，说明模型组心肌细胞存活数量明显减少；各干预组心肌细胞生长抑制率均显著低于模型组(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞生长抑制率的影响

2.2当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞氧化应激的影响 模型组心肌细胞SOD含量低于空白组，MDA和LDH含量高于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)；各干预组心肌细胞SOD含量均高于模型组，MDA和LDH含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表2。

表2 当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞氧化应激的影响

2.3当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞炎性因子的影响 模型组心肌细胞TNF-α和IL-1β含量均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；各干预组心肌细胞TNF-α和IL-1β含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。见表3。

表3 当归红芪超滤物对辐射致心肌细胞炎性因子的影响

3 讨 论

放疗作为肿瘤疾病治疗的主要手段之一，既可与手术、化疗等联合使用，也可单独使用，近年来放疗技术发展十分迅速，但是临床表明，放疗会导致患者心脏受到辐射损伤，增加心律失常、心包炎、心肌纤维化及心肌梗死等放射性心脏疾病的发生率〔6〕。放射性心脏疾病的发生机制较为复杂，可能与放射性直接损伤心肌细胞、血管及淋巴管等有关，因此明确疾病的发生机制对于改善预后具有重要意义〔7〕。本研究发现，模型组心肌细胞SOD含量明显低于空白组，MDA、LDH及TNF-α和IL-1β含量均明显高于空白组，说明新生大鼠心肌细胞在受到辐射后，机体抗氧化系统失衡致使氧自由基大量蓄积，产生过氧化作用，造成心肌细胞膜、核酸及蛋白质等生物大分子氧化损伤，导致心肌细胞形态、功能发生异常〔8,9〕，并且心肌还会产生促炎趋化因子，刺激TNF-α和IL-1β等炎性细胞因子合成，上调内皮细胞黏附分子表达，导致炎症细胞大量渗出，发生局部炎症反应，造成心脏微血管损伤及心肌细胞坏死等，诱发放射性心脏病〔10,11〕。

中医理论认为，辐射损伤属于热毒蕴结所致脾肾虚化和气血津液运行失常，因此应以益气补血、化瘀通脉的治疗为主，并兼顾提高免疫力、抗氧化应激以及抗辐射的中医治疗〔12〕。当归红芪超滤物是来源于当归补血汤，主要成分为当归和红芪中药，其中当归补血活血、通经活络，现代药理学研究表明，当归具有抗癌作用，用于化疗后正气虚弱的患者，可扶正抗癌，并具有抗氧化作用，可通过直接消除自由基，抑制氧化反应和自由基反应，减轻心脏组织的损害〔13〕；红芪可补气固表，现代药理学研究表明，红芪具有调节免疫功能、抗炎和抗氧化作用，并可扩张冠状动脉，改善心肌供血，增强心肌收缩力〔14〕。李应东等〔15〕研究表明，归红芪超滤物可提高大鼠心肌组织中的SOD和谷胱甘肽-过氧化物酶的活性，并降低MDA含量，进而发挥抗衰老作用；陈雪娟等〔16〕研究表明，当归红芪超滤物可通过降低心肌梗死大鼠LDH和LDH 同工酶活性，发挥抗心肌缺血损伤作用，有效保护大鼠心肌组织。本研究结果说明当归红芪超滤物可有效减轻辐射致新生大鼠心肌细胞的氧化损伤和免疫反应，进而保护心肌细胞，表现为各干预组心肌细胞生长抑制率明显低于模型组，同时本研究还发现，当归红芪超滤物对于心肌细胞生长抑制率、氧化应激及炎性因子指标放入改善呈现明显地剂量依赖性，说明用药剂量与心肌保护作用存在密切关系。

综上所述，当归红芪超滤物可有效改善辐射致新生大鼠心肌细胞的氧化应激及炎性因子指标，避免心肌细胞受损，并与剂量存在密切关系。