七株富硒乳酸菌的功能特性评价及其抗氧化活性

许牡丹， 贺佳璇， 徐 颖， 邬淑芳， 张 婷

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

乳酸菌是一种存在于人体内的益生菌，被应用于食品及药品行业，一般用来做发酵食品、保健食品及相关药品等[1].硒是人体必需的微量元素，能提高人体的免疫力，在抗癌、抗氧化等方面都具有相应的功效[2].生物氧化是有机物质在细胞内氧化分解产生二氧化碳、水，并释放出大量能量的过程.机体可通过膳食摄入抗氧化物质，提高机体抗氧化能力，然而化学抗氧化剂仍存在安全问题，达到一定量将损害人体生理机能.

乳酸菌的主要抗氧化成分为抗氧化多肽，是一种天然抗氧化剂.植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌等几种属于乳酸菌的菌种都具有富集硒的能力[3-6].研究表明，盐胁迫和热胁迫可以促进鼠李糖乳杆菌富硒能力.富硒乳酸菌可以作为一种添加物添加到功能食品中，在富硒食品的生产过程中要控制加入的量[7].

不同种属乳酸菌富硒能力不同[5].Yang等[8]探究发现保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌对硒的积累量分别达到12.05±0.43μg/mL和11.56±0.25μg/mL，富硒乳酸菌比对照具有更强的抗菌活性.实验评估了5株食品级乳酸杆菌菌株的益生菌潜力，显示出在pH为2的模拟胃液中存活的能力，这些培养物也在含有1%胆汁盐的模拟肠液中存活[9].研究发现从不同食物中筛选出的乳酸菌其特性不同，来自开菲尔粒的菌株在抗菌活性和胆汁盐脱除方面有更好的特性，来自原料乳的菌株具有更好的疏水性和抗氧化特性[10].通过富硒提高乳酸菌抗氧化活性，对天然抗氧化剂的开发有重要意义.在实验的基础上选取了7株乳酸菌对其进行体外功能特性评定，为富硒乳酸菌及其富硒食品的研发提供理论和实践依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠李糖乳杆菌(ATCC 53103，LGG)、嗜热链球菌(BNCC 335885，ST)、嗜酸乳杆菌(ZK-AS 1.2686，LA)、保加利亚乳杆菌(ZK-GIM 1.155，LB)、罗伊氏乳杆菌(ATCC 23272，LR)、干酪乳杆菌(ZK-AS 1.1482，LC)、植物乳杆菌(ATCC 8014，LP)由实验室提供；亚硒酸钠，山东西亚化学工业有限公司；MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司.其他试剂均为常见分析纯.

1.2 仪器

722E型分光光度计，上海光谱仪器有限公司；Varioskan Flash全波长多功能扫描读数仪，赛默飞世尔科技有限公司；其他均为实验室常见仪器.

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

将冷冻保存的各菌株接种于MRS中，37 ℃培养24 h后，再活化两次.

1.3.2 富硒乳酸菌功能特性评估

将活化好的乳酸菌分别接种于含亚硒酸钠和不含亚硒酸钠的液体MRS培养基中，37 ℃下培养24 h，4 000 r/min 离心5 min.菌体用无菌生理盐水反复洗涤，用生理盐水重悬并调整菌数为 1×109CFU/mL，制成菌悬液.

(1)菌株疏水性测定

调节菌液浓度使A600的值为0.5.将3 mL乳酸菌悬液加入到1 mL二甲苯、三氯甲烷和十六烷中，剧烈涡旋2 min.静置30 min后取水相，测量水相的A600值，并与初始值进行比较.按式(1)计算疏水性:

(1)

(2)体外模拟胃肠液存活率试验

将稀释好的菌液加入模拟胃液中，37 ℃培养，在1 h、2 h、3 h进行活菌计数.3 h后，取每个菌悬液，加入相同体积的肠液.在 37 ℃下培养，在1 h和3 h进行活菌计数.存活率以不同时间的CFU/mL与0 h的CFU/mL的百分比计算.

(3)菌株降胆固醇能力测定

将菌液加入MRS-胆固醇培养基内，37 ℃培养24 h，并做空白组实验.采用邻苯二甲醛法对乳酸菌降胆固醇能力进行测定[11].

1.3.3 富硒乳酸菌抗氧化能力测定[12]

分别收集发酵上清液及沉淀菌体，将1.3.2得到的菌悬液分为两组，一组为菌悬液组，另一组用于胞内无细胞提取物(CFE)的制备.将乳酸菌菌悬液冰浴超声波破碎细胞(工作2 s 间歇1 s，输出功率100 w)10 min后，在4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，收集上清液，即为CFE.

(1) DPPH自由基清除率

将2 mL上清液、菌悬液或CFE和2 mL的0.2 mmol/L DPPH·无水乙醇溶液混合，并在黑暗中反应30 min.通过测量517 nm处吸光度的降低来监测DPPH清除率.空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以无菌水代替样品.按式(2)计算清除率:

(2)

式(2)中：Ai-样品组的吸光度;Aj-空白组的吸光度;A0-对照组的吸光度.

(2)羟自由基清除率

将0.5 mL 1,10-邻菲罗啉(6 mmol/L)与1 mL PBS(pH 7.2)混合，混匀后加入0.5 mL硫酸亚铁(6 mmol/L)，立即混匀，加0.5 mL样品后加入0.5 mL 过氧化氢(0.1%)和无菌水，最终总体积为4 mL.混合物在37 ℃孵育1 h，同时进行空白实验.在536 nm处读取吸光值.使用式(3)计算羟自由基(OH-)清除能力:

(3)

式(3)中：AS-样品吸光度；A1-有1,10-邻菲罗啉、硫酸亚铁和H2O2的对照溶液吸光度；A0-有1,10-邻菲罗啉和硫酸亚铁的空白溶液吸光度.

(3)超氧阴离子自由基清除率

将0.1 mL样品与4.5 mL、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液混合，25 ℃水浴20 min后，加入0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚，于25 ℃水浴反应5 min，立即用2滴8 mol/L的HCl 终止反应，在325 nm波长处测吸光值即为A，用蒸馏水调零.空白组用无菌水代替样品即为A0，按式(4)计算清除率：

(4)

1.3.4 谷胱甘肽过氧化物酶活性和硫氧还蛋白还原酶活性测定

谷胱甘肽过氧化物酶活性按照文献[13]进行测定.硫氧还蛋白还原酶活性采用硫氧还蛋白还原酶ELISA测定试剂盒(上海通蔚科技有限公司)，按照说明操作.

2 结果与讨论

2.1 富硒乳酸菌功能特性评估

2.1.1 菌株疏水性测定

疏水性是益生菌细胞粘附肠道上皮细胞的重要指标之一，疏水性越高，益生菌粘附特性越好[14].脂蛋白可能影响革兰氏阴性菌的表面疏水性[15]，通过利用表面疏水性和其他特性可以筛选出最佳益生菌特性的菌株.由图1可知，菌液与不同的有机溶剂疏水性大小依次为：三氯甲烷>十六烷>二甲苯.富硒后除保加利亚乳杆菌外其他菌株对二甲苯的疏水性都有提高，保加利亚乳杆菌的疏水性最大为17.33±0.27%，与空白组相比提高了6.75%.鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌富硒后对三氯甲烷的疏水性都有提高，其中罗伊氏乳杆菌的疏水性最大为30.88±0.41%，提高了0.35%.干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌富硒后对十六烷的疏水性都有提高，罗伊氏乳杆菌的疏水性最大为47.88±0.39%，提高了18.95%.

图1 乳酸菌富硒前后疏水性

2.1.2 体外模拟胃肠液存活率

由表1可知，不同培养时间菌株的存活率不同，富硒培养使不同时间活菌数有所提高.在模拟胃液中1 h后，菌株存活率较高，鼠李糖乳杆菌存活率最高为96.41±0.71%，嗜热链球菌通过富硒存活率提高，是空白组的1.06倍.2 h后，富硒嗜酸乳杆菌与空白组相比提高了5.75%.3 h后，富硒乳酸菌相比空白组存活率较高，植物乳杆菌提高最大，是空白组的1.09倍.在模拟肠液中1 h后，七株菌株存活率较高，嗜酸乳杆菌富硒后提高了3.21%.3 h后，乳酸菌存活率仍然较高，鼠李糖乳杆菌存活率最高为73.34±0.96%，是空白组的1.02倍.乳酸菌对胃肠环境的耐受性和对肠上皮细胞的粘附与luxS/AI-2有关，研究表明了luxS基因在植物乳杆菌KLDS1.0391的抗逆性和粘附能力中的作用[16].由于菌株的特异性，不同菌株对胃肠液的耐受性存在显著差异(P<0.05)，因此，通过体外模拟胃肠道环境筛选高存活率益生菌具有重要意义[17].

表1 七株乳酸菌富硒培养前后体外模拟胃肠液存活率测定

2.1.3 降胆固醇能力测定

由图2可知，富硒培养后鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的胆固醇去除率没有发生明显变化，其余菌株都有显著提高，嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌去除率较高，分别为83.33±1.73%和81.21±1.05%，是空白组的1.04倍.干酪乳杆菌去除率提高最大，与空白组相比提高了13.76%，实验表明富硒可以提高部分乳酸菌的降胆固醇能力.Rossi等[18]认为胆固醇通过掺入细胞膜方式，从而改变细胞膜的韧性.Wang等[19]研究发现植物乳杆菌显著降低了大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇.

图2 乳酸菌富硒前后胆固醇去除率

2.2 乳酸菌抗氧化能力测定

由图3可知，富硒培养对所有菌株发酵上清液的DPPH自由基清除率都有显著提高，植物乳杆菌提高最大，与空白组相比提高了14.04%.除保加利亚乳杆菌外，富硒对所有菌株菌悬液的DPPH自由基清除率都有显著提高，鼠李糖乳杆菌提高最大，与空白组相比提高了10.46%.富硒培养对所有菌株CFE的DPPH自由基清除率都有显著提高，其中干酪乳杆菌提高最大为28.62±0.68%，是空白组的1.89倍.

(a)上清液

(b)菌悬液

(c)CFE图3 乳酸菌不同组分DPPH自由基清除率

由图4可知，富硒培养对所有菌株发酵上清液的羟自由基清除率都有显著提高，罗伊氏乳杆菌提高最大为80.28±1.32%，与空白组相比提高了37.85%，富硒培养后鼠李糖乳杆菌和保加利亚乳杆菌的清除率最高，分别为89.72±0.98%和87.48±0.79%.富硒对大部分菌株菌悬液的羟自由基自由基清除率有显著提高，其中干酪乳杆菌提高最大，提高了7.97%，嗜酸乳杆菌清除率最高为46.92±0.88%.富硒培养大部分菌株CFE的羟自由基清除率有显著提高，鼠李糖乳杆菌提高最大，与空白组相比提高了10.46%，同时清除率最高为42.7±0.93%.

(a)上清液

(b)菌悬液

(c)CFE图4 乳酸菌不同组分羟自由基清除率

由图5可知，富硒培养对所有菌株发酵上清液的超氧阴离子自由基清除率都有显著提高，植物乳杆菌提高最大，是空白组的1.55倍.保加利亚乳杆菌的清除率最高为83.94±1.05%，是空白组的1.21倍.富硒对大部分菌株菌悬液的超氧阴离子自由基清除率有显著提高，嗜酸乳杆菌提高最大，与空白组相比提高了28.86%，嗜热链球菌的清除率最高，达到72.72±1.21%，是空白组的1.18倍.CFE的超氧阴离子自由基清除率有显著提高，鼠李糖乳杆菌提高最大，是空白组的1.81倍.植物乳杆菌的清除率最高为24.8±0.54%.

(a)上清液

(b)菌悬液

(c)CFE图5 乳酸菌不同组分超氧阴离子 自由基清除率

由于不同的菌株其清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基能力的不同，所以其抗氧化机制有所差异[20]，刘洋等[21]的研究也反映出这一点.由结果可知七株乳酸菌抗氧化能力各不相同，可能是起抗氧化作用的活性物质本质或浓度不同，推测其可能为不同抗氧化酶类[13].同一株乳酸菌的菌悬液、上清液及CFE的抗氧化能力也存在较大差异，说明富集的硒及受硒影响的抗氧化活性物质(酶)可能主要存在于菌体表面或内部，通过富硒影响相关蛋白的表达，从而影响酶活力[22].

2.3 谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶活性

由图6可知，七株乳杆菌富硒后的GSH-Px活性都有提高，其中鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌提高显著，分别是空白组的1.14、1.35和1.21倍.

富硒可促进谷胱甘肽过氧化物酶的产生，硒添加量与GSH-Px活性有关联，即在一定范围内乳酸菌的GSH-Px活性随着硒添加浓度的增加而增加，当亚硒酸钠浓度升高到一定程度时，GSH-Px活性略有降低.硒是GSH-Px 的催化位点中的硒代半胱氨酸合成的必要元素，可能是由于当亚硒酸钠浓度过高时，抑制硒代半胱氨酸的合成，从而不会使GSH-Px活性持续增加.Tang等[22]研究发现植物乳杆菌LactobacillusplantarumMA2发酵上清液和细胞匀浆均表现出谷胱甘肽过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性.

由图7可知，鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌富硒培养后其TrxR活性略有降低.干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的TrxR活性有提高，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌的TrxR活性有较大提高，空白组分别为3.46±0.35 mU/L、4.23±0.37 mU/L和5.92±0.49 mU/L，富硒培养后分别是空白组的1.32、1.29和1.11倍.七株菌株中，植物乳杆菌的TrxR活性最大为6.57±0.38 mU/L.

硫氧还蛋白系统与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长及肿瘤发生有关[23].五株乳酸菌酶活有提高，两株乳酸菌酶活有略微下降.硫氧还蛋白还原酶的活性与体内硒含量密切相关[24]，虽然该酶是含硒酶，但不是所有乳酸菌经过富硒培养一定能提高其酶活.酶活性降低可能是由于富硒能力较低，只能转化少部分亚硒酸钠生成单质硒，亚硒酸钠的存在可能会影响酶的合成.

图6 七株富硒乳酸菌的GSH-Px活性

图7 七株富硒乳酸菌的TrxR活性

3 结论

对不同种属乳酸菌的功能特性进行测定，探究富硒乳酸菌的疏水性、模拟胃肠液存活力等特性，通过自由基清除实验对七株乳酸菌富硒前后的抗氧化能力进行评比较，并测定GSH-Px和TrxR活性.疏水性结果表明，乳酸菌富硒可以提高其疏水性.模拟胃肠液存活率和胆固醇去除率测定结果表明，相比于空白组，乳酸菌存活和胆固醇去除率有所提高.抗氧化实验结果表明，富硒乳酸菌在 DPPH自由基清除率、羟自由基清除率等方面有显著提高.通过测定GSH-Px及TrxR活性，探究富硒对起抗氧化作用的物质的影响，发现富硒可以提高乳酸菌两种酶活力.本研究对不同种属的富硒乳酸菌生物活性进行基础性的体外测试，然而，对于其具体作用机理和其他抗氧化物质有待进一步探究和阐明.