姜黄素对四氯化碳诱导鲤肝脏损伤的修复作用

张媛媛，宋理平，郭 辉，王晓丽

姜黄素对四氯化碳诱导鲤肝脏损伤的修复作用

张媛媛1，宋理平1，郭 辉2，王晓丽1

（1. 山东省淡水渔业研究院，山东 济南 250013；2. 山东大学齐鲁儿童医院，山东 济南 250022）

【】研究姜黄素对四氯化碳诱导的鲤（）肝脏损伤的修复作用，为筛选治疗鱼类肝脏综合征的绿色药物提供理论依据。在基础饲料中分别添加0、60、120、240 mg/kg姜黄素，制备4种等氮、等能饲料。试验设5组，阴性对照组注射橄榄油，饲喂基础饲料，阳性对照组和各姜黄素组注射体积分数15%的CCl4溶液，分别以添加0、60、120、240 mg/kg姜黄素饲料饲喂14 d，测定各组谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活力，丙二醛（MDA）含量，血浆总蛋白（TP）含量，总能氧化能力（T-AOC），肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，以及肝细胞核相关转录因子2（Nrf2）含量等指标，并对各组肝脏细胞进行组织学观察，研究姜黄素对鲤肝损伤的修复作用。在四氯化碳诱导初期，阳性对照组，60、120、240 mg/kg姜黄素组的GPT、GOT活力和MDA含量显著高于阴性对照组(< 0.05)，随着投喂时间的增加，各姜黄素组GPT、GOT活力和MDA含量平均值均有不同程度的降低，其中，120 mg/kg组的GPT、GOT活力和MDA含量以及240 mg/kg组的GPT活力差异显著(< 0.05)；TP含量，T-AOC、SOD、GSH-Px活力，GSH含量的变化趋势与GPT和GOT等相反，且随着投喂时间的增加，120 mg/kg组的T-AOC、SOD、GSH-Px活力和TP、GSH含量以及240 mg/kg组的SOD、GSH-Px活力和GSH含量呈先降后升趋势(< 0.05)，其余各组差异均不显著 (> 0.05)；肝脏组织切片显示，饲料中添加姜黄素可一定程度上修复鲤鱼幼鱼的肝脏损伤，且以120 mg/kg组效果最佳；饲料中添加姜黄素可提高鲤鱼肝脏mRNA表达量，促使Nrf2由肝细胞质转至细胞核中。姜黄素可通过介导Nrf2提高鲤鱼相关抗氧化酶的活力，对鱼体的肝脏损伤进行修复。当姜黄素的添加水平为120 mg/kg时，机体的抗氧化功能最强，对肝脏损伤的修复作用最强。

鲤；肝脏损伤；修复；姜黄素；Nrf2

鱼类在水产养殖过程中常受抗生素等药物或化学物质的应激，致使其生理动态平衡严重紊乱。CCl4等有毒物质的侵袭可直接作用于肝脏细胞膜、细胞器膜或生物大分子，导致鱼体肝脏膜脂质过氧化，膜蛋白变性，膜结构性损坏，最终导致肝细胞坏死[1]，俗称肝胆综合征，近年来较为频发，死亡率高。目前，关于鱼类肝胆综合征的治疗主要以抗生素为主，但鱼类内服抗生素等药物不仅会引起肠道反应而食欲不振，还对鱼体肝胆、肾脏等造成直接损伤，且易在鱼类体内产生耐药性，并造成药物残留而威胁人类健康[2-3]。姜黄素是目前世界上销量最大的天然食用色素之一，其毒性低、不良反应少，是世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多个国家认定的安全药物[4]。2014年，农业部批准姜黄素作为新饲料添加剂，现已证明其有杀菌消炎[5-6]、抗氧化[7]、清除自由基[7]及抗癌[8]等多种功效。有研究显示，姜黄素可明显激活人类肝癌细胞中HepG2细胞的核相关转录因子2（nuclesr factor crythroid 2-related factor 2, Nrf2）系统，并对抗葡萄糖氧化酶，（glucose oxidase, GO）氧化应激所致的蛋白激酶B （protein kinase B，PKB）磷酸化损害[9]，亦可通过诱导Nrf2活性对蛋氨酸-胆碱所引起的小鼠（）非酒精性脂肪肝炎有一定保护作用[10]，还可保护人类或小鼠等免受镉[11]、汞[12]等毒性物质引起的肾脏、睾丸等组织严重损伤[13]。目前对姜黄素的应用研究主要在哺乳动物方面，在鱼类中的研究尚处起步阶段，主要集中在对机体的促生长、提高免疫以及抗氧化功能方面，即姜黄素对大黄鱼（）[14]、罗非鱼（）[15]、草鱼（）[16]、大菱鲆（）[17]等生长、消化吸收、非特异性免疫和抗氧化功能研究。在姜黄素对鱼体肝脏损伤方面研究仅见对草鱼[18]、建鲤（var.）[19]和鲫（）肝细胞[20]急性肝脏损伤的保护作用研究，缺乏对鱼类肝脏损伤修复作用的研究。本研究以CCl4构建鱼体肝脏损伤模型，结合鱼体生理、抗氧化及相关分子指标，探讨姜黄素可否通诱导Nrf2活力，对鱼体肝脏损伤进行修复，为姜黄素作为无公害中成渔药在鱼病防治中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼与养殖管理

幼鲤（）约50 g，由山东省淡水渔业研究院良种场提供。试验开始前，用通威饲料公司提供的沉性饲料暂养1周，随机将450尾大小、规格、体质基本一致的幼鱼随机放入15个循环水养殖桶（水体积250 L）中，试验分为5组。每组试验所用循环桶在空间位置上随机分散排布，减少试验组之间因光线等因素造成的误差。每天分别于8:30、12:30和4:30近饱食投喂1次，每次投喂持续30 min以上。每天吸污1次，饲养期间水温24.5 ~ 27.5 ℃，溶解氧6 mg/L以上，氨氮0.1 mg/L以下，亚硝酸盐0.1 mg/L以下，pH 6.8 ~ 7.0。

1.2 试验设计

对鲤鱼腹腔注射由橄榄油稀释的体积分数5%、10%、15%、20%、25%、30% CCl4，观察7 d，确定造成鲤鱼肝脏损伤但不致死的CCl4体积分数为15%。

试验分为5组，每组3个平行，每个平行30尾鱼。试验组按每100 g体质量0.5 mL的比例对鲤鱼腹腔注射体积分数15%的CCl4溶液(溶于橄榄油)，注射12 h后，鲤鱼出现明显的活力弱、不进食等病症，向鱼体饲喂添加0（基础饲料，阳性对照）、60、120、240 mg/kg姜黄素饲料；阴性对照组按相同比例腹腔注射橄榄油，养殖模式处理同试验组，饲喂无添加姜黄素饲料（基础饲料）。在开始投喂饲料时以及投喂后1、4、7、14 d时分别采样，分析姜黄素对CCl4诱导的肝脏损伤的影响。

1.3 试验饲料

由山东省淡水渔业研究院营养与饲料加工研究室制备。将饲料原料粉碎，过孔径380 μm的筛，采用逐级混匀方法充分混匀原料，加水后用小型颗粒机（SLP-45，中国水产科学研究院渔业机械研究所）制成直径为3 mm的颗粒，基础饲料见表1。

表1 试验饲料配方与营养水平

注：1）每千克维生素预混料包含以下维生素：VA, 900 000 IU; VD,200 000 IU; VE, 4 500 mg; VK3, 220 mg; VB1, 320 mg; VB2, 1090 mg; 烟酸 2 800 mg; VB5, 2 000 mg; VB6, 500 mg; VB12, 1.6 mg; VC, 5 000 mg; 泛酸, 1 000 mg; 叶酸, 165 mg; 胆碱, 60 000 mg。

2）每千克矿物质预混料包含以下矿物质：FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g。

Notes: 1) One kilogram vitamin premix supplied the following vitamins: Vitamin A, 900000 IU; Vitamin D, 200000 IU; Vitamin E, 4500 mg; Vitamin K3, 220 mg; Vitamin B1,320 mg; Vitamin B2, 1090 mg; Niacin, 2800 mg; Vitamin B5, 2000 mg; Vitamin B6, 500 mg; Vitamin B12, 1.6 mg; Vitamin C, 5000 mg; Pantothenate, 1000 mg; Folic acid, 165 mg; Choline, 60000 mg.

2) One kilogram mineral premix supplied the following minerals: FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g.

1.4 采样与处理

每桶随机取鱼3尾，用100 mg/L的MS-222快速深度麻醉，采血（尾静脉），血样在抗凝管中以4 ℃、6 000 r/min条件离心10 min，制备的血浆于‒80 ℃下冻存备用。每尾鱼同时采集肝脏，一部分存于波恩氏液中以备切片用，另一部分存储在‒80 ℃冰箱以进一步分析。

1.4.1 血浆肝功能指标测定 总蛋白(TP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和总抗氧化能力(T-AOC) 用南京建成生物工程研究所科技有限公司试剂盒采用比色法测定。

1.4.2 肝脏抗氧化指标测定 冻存的肝脏样品在4 ℃冰箱溶解后，用生理盐水冲洗去血液，用滤纸吸干，以生理盐水为介质按照1∶9（1 g组织样品、9 mL生理盐水）制成匀浆液，离心10 min (3 000 r/min)，取上清液，用南京建成生物工程研究所科技有限公司试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 和谷胱甘肽(GSH)。SOD活力由黄嘌呤氧化产生活性氧阴离子(O2-) 的清除率来计算[21]，MDA含量、GSH和GSH-Px活力用比色法测定[22]。

1.4.3 组织形态学分析 每个网箱中随机取鱼3尾，麻醉，在冰盘上剖取肝脏，放入预先配制好的波恩氏固定液(体积分数1.22%的饱和苦味酸75 mL，体积分数40%甲醛溶液25 mL，冰醋酸5 mL)中固定[23]。然后水洗，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片(切片机型号为Leica RM-2255，德国)，附贴于用蛋白甘油处理过的载玻片上进行HE染色，用中性树胶封片，置于光学显微镜(NIKON DS-Fi1) 下观察。

1.4.4 肝脏mRNA测定 用天根生物科技有限公司的试剂盒采用Trizol法提取各时间段的鲤鱼肝组织总RNA，测定总RNA纯度，使OD260/OD280为1.8 ~ 2.0，并凝胶电泳检测总RNA质量；利用反转录试剂盒 (天根生物科技有限公司) 反转录为 cDNA；根据鲤鱼mRNA的基因全序列设计引物(表2) 进行实时荧光定量PCR反应，反应条件： 95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，循环40次。Sybergreen 法检测目的基因的扩增，β-actin为内参基因，所有反应均设3个重复。mRNA水平采用2-ΔΔCt法计算[24]。

1.4.5 核内Nrf2含量监测 采用western blot技术检测肝脏细胞核内Nrf2含量。取鲤肝组织100 mg，用溶液法抽提总蛋白，Bradford法测定蛋白质浓度，变性后电泳，蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用50 g/L脱脂奶粉TBS溶液于室温下封闭2 h，用Nrf2一抗 (1∶1 000，武汉三鹰生物技术有限公司) 于4℃下孵育18 ~ 24 h，用洗膜缓冲液TBST（Tris Buffered Saline Tween）洗膜3 次，每次8 min，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗(1∶10 000，Jackson ImmunoResearch) 室温下孵育2 h，用TBST同法洗膜3 次，进行2 min的免疫印迹化学发光（ECL）反应，暗室中曝光、显影和定影。用HRP偶联内参GAPDH一抗孵育2 h 后，用TBST 洗膜4 次，每次10 min，进行2 min ECL反应，同法曝光、显影和定影。利用QuantiScan 3.0 软件测量目的蛋白和内参蛋白条带灰度值，相对表达量以Nrf2灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示。

表2 Nrf2基因荧光定量PCR引物

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，数据差异显著时，采用Duncan’s检验法进行多重比较, 差异水平定为0.05。试验结果以平均值±标准误(Mean±S.E.M) 表示。

2 结果与分析

2.1 四氯化碳诱导肝脏损伤后姜黄素对鲤血液生理指标的影响

图1可见，经四氯化碳诱导损伤后鲤血浆GPT活力受姜黄素投喂时间影响显著。阴性对照组GPT活力在整个试验期内较为稳定，活力较低；阳性对照组，120、240 mg/kg姜黄素组的GPT活力呈先升后降的变化趋势 (< 0.05)，而60 mg/kg姜黄素组无显著差异。此外，鲤鱼血浆GPT活力也受姜黄素添加量的影响。在投喂饲料1 d时，阳性对照组和各姜黄素组的GPT活力均显著高于阴性对照组(< 0.05)；投喂4 d时，阳性对照组显著高于阴性对照组 (< 0.05)，60、120、240 mg/kg组平均值高于阴性对照但差异不显著 (> 0.05)；投喂7 d时，120 mg/kg组的GPT活力显著低于阳性对照组 (< 0.05)，与阴性对照组无显著差异，60、240 mg/kg组平均值也低于阳性对照组，但差异不显著；投喂14 d时，各姜黄素组的GPT活力与阴性对照组均无显著差异。

如图1所示，四氯化碳诱导肝脏损伤后鲤鱼血浆中GOT活力与GPT活力相似，亦受姜黄素添加量和饲料投喂时间的显著影响。阳性对照组和120 mg/kg组的GOT活力随着饲料投喂时间的增加均出现先升后降的变化趋势 (< 0.05)，而60、240 mg/kg组的变化并不明显。此外，在投喂饲料1 d时，阴性对照组GOT活力显著低于阳性对照组和各姜黄素组 (< 0.05)；投喂4 d时，阴性对照组GOT活力显著低于阳性对照组和240 mg/kg组(< 0.05)，而与60 和120 mg/kg组差异不显著 (> 0.05)；投喂7 d时，阴性对照组和120 mg/kg组的GOT活力显著低于阳性对照组 (< 0.05)，60和240 mg/kg组的GOT活力与阳性对照组、阴性对照组和120 mg/kg组均无显著差异(> 0.05)。

数值为平均值±标准误，n = 9；小写字母分别表示不同剂量组间Duncan多重比较，大写字母分别表示不同时间点间Duncan多重比较，凡含一个相同字母或无字母时无显著性差异（P > 0.05）。

图2可见，饲料中添加姜黄素显著影响四氯化碳诱导鲤鱼肝脏损伤后血浆中TP含量。随着投喂时间增加，120 mg/kg组的TP含量呈先降后升变化趋势 (< 0.05)，其他各组均无显著差异 (> 0.05)；在投喂1 d时，阳性对照组及240 mg/kg组的TP含量低于阴性对照组，60、120 mg/kg组的TP含量平均值低于阴性对照组但差异不显著 (> 0.05)；投喂4 d时，阳性对照组的TP含量显著低于阴性对照组 (< 0.05)，其余各组之间差异均不显著(> 0.05)；投喂7 d时，120 mg/kg组的TP含量回升至阴性对照组水平 (> 0.05)，且120 mg/kg组平均值高于60和240 mg/kg组，但差异不显著(> 0.05)；投喂14 d时，60、120 mg/kg组的TP含量显著高于阳性对照组 (< 0.05)，与阴性对照组和240 mg/kg组差异不显著 (> 0.05)。

数值为平均值±标准误，n = 9；小写字母分别表示不同剂量组间Duncan多重比较，大写字母分别表示不同时间点间Duncan多重比较，凡含一个相同字母或无字母时无显著性差异（P > 0.05）。

图2可见，经CCl4诱导后，鲤鱼血浆T-AOC受姜黄素添加量影响显著。随着投喂时间的增加，120 mg/kg组的T-AOC和TP含量的变化趋势基本相同，均呈先降后升变化趋势 (< 0.05)，其他各组之间无显著差异(> 0.05)；在投喂1 d时，阳性对照组的T-AOC显著低于阴性对照组，与其他各组无显著性差异，在其他时间点，姜黄素添加量的不同对鲤血浆T-AOC并未造成显著影响。

2.2 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏抗氧化指标的影响

图3可见，CCl4诱导后，肝脏SOD活力和MDA含量均受姜黄素添加量和投喂时间显著影响。随着投喂时间的增加，120、240 mg/kg组的SOD活力呈先降后升趋势 (< 0.05)，其他各组无显著差异。在投喂饲料1 d时，与阴性对照组相比，阳性对照组和240 mg/kg组的肝脏SOD活力显著降低 (< 0.05)，60和120 mg/kg组的平均值降低，但差异不显著 (> 0.05)；在投喂4 d时，各姜黄素组SOD活力平均值高于阳性对照组，低于阴性对照组，但差异并不显著 (> 0.05)。MDA含量则呈相反趋势，当姜黄素的添加量为120 mg/kg时，随着投喂时间的增加，肝脏MDA含量呈先升后降趋势（< 0.05）。

数值为平均值±标准误，n = 9；小写字母分别表示不同剂量组间Duncan多重比较，大写字母分别表示不同时间点间Duncan多重比较，凡含一个相同字母或无字母时无显著性差异（P > 0.05）。

图4可见，经CCl4诱导后，肝脏中GSH-Px和GSH活力均受饲料投喂时间和姜黄素添加量显著影响。随着投喂时间的增加，120、240 mg/kg组GSH-Px活力和GSH含量均呈先降后升趋势 (< 0.05)，其他各组无显著差异 (> 0.05)。试验开始时，阳性对照组和各姜黄素组肝脏GSH平均值较阴性对照组有所下降，但差异不显著，而与阴性对照组相比，各组GSH-Px活力显著下降 (< 0.05)；在投喂1 d时，阳性对照组和各姜黄素组的GSH-Px活力显著低于阴性对照组 (< 0.05)，而与阴性对照组相比，阳性对照组的GSH含量显著降低(< 0.05)，各姜黄素组的GSH含量有所下降，但差异不显著(> 0.05)；在投喂4 d时，各姜黄素组的GSH和GSH-Px活力平均值与前一次采样相比均有所升高 (> 0.05)，且与阴性对照组相比无显著差异，各组间差异也不显著 (> 0.05)；在投喂7、14 d时，各姜黄素组GSH和GSH-Px活力基本恢复至正常水平，各组间无显著差异 (> 0.05)。

2.3 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏组织结构的影响

图5可见，投喂饲料1 d时，在油镜（×1000）下，阳性对照组、60、120及240mg/kg组的肝细胞出现严重空泡及细胞膨大现象，大部分肝细胞的细胞核大而明显且出现偏移，大量细胞核出现聚集现象，更有甚者，肝细胞有出血现象。而阴性对照组的肝细胞形状较为正常，无细胞膨大及明显的脂肪空泡现象；细胞核大小适中，分布于细胞中间。在投喂7 d时，阳性对照组和60 mg/kg组仍有细胞核聚集和脂肪空泡化等现象；此外，120 mg/kg组肝脏细胞形状较为正常，无明显细胞膨大和脂肪空泡现象，细胞核大小适中，分布于细胞中间；240 mg/kg组虽有些许脂肪空泡，但与投喂1d相比症状已减轻。

数值为平均值±标准误，n = 9；小写字母分别表示不同剂量组间Duncan多重比较，大写字母分别表示不同时间点间Duncan多重比较，凡含一个相同字母或无字母时无显著性差异（P > 0.05）。

图5 姜黄素对鲤鱼肝脏组织结构的影响

2.4 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏中Nrf2 mRNA表达量的影响

图6可见，经四氯化碳诱导后，鲤鱼肝脏mRNA表达量受姜黄素添加量影响显著。在试验开始及投喂1 d时，各组间肝脏mRNA表达量均无显著差异 (> 0.05)；在投喂4 d时，120 mg/kg组mRNA表达量显著高于阴性对照组和阳性对照组 (< 0.05)，其余各组间差异均不显著 (> 0.05)；在投喂7、14 d时，各姜黄素组mRNA表达量均显著高于阴性对照组 (< 0.05)，而阳性对照组表达量平均值高于阴性对照组，但差异不显著 (> 0.05)。

数值为平均值±标准误，n = 9；小写字母分别表示不同剂量组间Duncan多重比较，大写字母分别表示不同时间点间Duncan多重比较，凡含一个相同字母或无字母时无显著性差异（P > 0.05）。

2.5 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏细胞核Nrf2蛋白水平的影响

如图7所示，在投喂饲料7 d后，鲤鱼肝脏细胞核中的Nrf2含量受姜黄素添加量影响。与阴性对照组相比，阳性对照组，60、120、240 mg/kg组的肝脏细胞核内Nrf2含量均升高，其中，120 mg/kg组最高。

3 讨论

3.1 四氯化碳诱导肝脏损伤后姜黄素对鲤鱼血液生理指标的影响

动物血液生理指标可用来判断机体的基础代谢和营养状况。通过血液生理指标的变化可判断机体的营养和健康状况以及对环境的适应情况[25]。肝脏是动物机体最主要的代谢器官，具有抗氧化、代谢蛋白质及储存糖元等功能，肝脏损伤可严重影响机体的健康。GPT和GOT是鱼类最重要的转氨酶，主要存在于肝脏中，可在一定程度上反映肝脏的生理状态[26]。当肝细胞受损时，肝脏细胞膜的通透性会发生改变，GPT和GOT会被大量释放到血液中，因而被认为是检测肝功损害最具有特异性的重要指标[27]。本研究中，在四氯化碳诱导鲤鱼肝脏损伤初期，阳性对照组及60、120、240 mg/kg姜黄素组的血浆GPT和GOT活力显著高于阴性对照组；但随着投喂饲料时间的延长，与阳性对照组相比，3个姜黄素组的GPT和GOT活力平均值均有所降低，其中，120 mg/kg组的血浆GPT和GOT活力较60、240 mg/kg组差异更为显著。这说明姜黄素在一定程度上对鲤鱼幼鱼肝脏损伤具有修复作用。

血浆TP含量是反应机体营养和代谢水平的重要指标，可维持正常的渗透压和恒定的pH，并与脂肪、胆红素、胆固醇和磷酸等的转运相关。而肝脏是蛋白质合成的唯一场所，当肝脏损伤时，血液TP含量将显著降低，因而，血液中TP含量也可作为检测肝脏受损程度的重要指标[28]。有学者认为，在运输、氨氮、病原菌感染等急性应激下血液蛋白含量将增加，而在慢性应激下将降低[29-30]。然而张春暖[31]研究表明，在急性热应激和氨氮应激24 h后，团头鲂（Yih）血浆TP含量显著降低。黄琪琰等[32]对异育银鲫（）溶血性腹水病的病理及生理反应进行了研究，结果显示患病鱼体的血液TP含量显著低于健康鱼。本研究中，在四氯化碳诱导初期，阳性对照及各姜黄素组TP含量显著降低，与团头鲂急性热应激后TP含量的变化一致。随投喂时间的增加，各姜黄素组TP含量逐渐提升， 120 mg/kg组对TP含量的提升效果最为明显， 240 mg/kg组提升效果最差。说明饲料中添加姜黄素可在一定程度上促进蛋白质的合成，从而达到抗氧化应激的目的，且当姜黄素添加量为120 mg/kg时效果最优。Harikrishnan等[33]研究植物提取物对鲤生理反应的影响时表明，日粮中添加中草药提取物能增加血液中的TP含量，使鱼体抵抗氧化应激反应，与本研究结论一致。这可能是因为姜黄素可一定程度上提升机体的免疫功能，可通过提高机体的非特异性免疫能力来促进机体代谢，从而维持机体抗氧化平衡，进而达到修复肝脏损伤的目的[34]。

3.2 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏相关抗氧化酶和Nrf2 mRNA表达量的影响

SOD是目前为止发现的唯一以超氧阴离子自由基（O2-）为底物的酶，可催化O2-转化为H2O2和O2。谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 又可通过还原性谷胱甘肽 (GSH) 将H2O2催化生成水，以达到抵抗体内自由基的目的。MDA是羟基阴离子 (•OH) 攻击细胞膜后脂质过氧化的产物。这些相关抗氧化酶在机体中参与肝脏Ⅱ相代谢反应，俗称Ⅱ相代谢酶。细胞转录因子Nrf2是细胞防御氧化应激的重要调节因子，与机体的防御系统密切相关，可通过与机体肝脏酶促反应中相关代谢酶中启动子区域特定的DNA序列组成的抗氧化反应元件（antioxidant responsive element, ARE）相互作用，上调多种抗氧化酶及解毒酶，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物质的表达水平[35-36]，从而保护机体组织免受有毒物质的攻击。本研究中，四氯化碳诱导初期，除阴性对照组外，其他各组SOD、GSH-Px活力和GSH含量均出现不同程度的降低，MDA含量却相反，这说明四氯化碳对鲤鱼幼鱼肝脏造成了一定损伤。而当投喂饲料7 d时，阳性对照组和各姜黄素组的SOD、GSH-Px活力和GSH含量较投喂1 d时，均出现不同程度的提高，除240 mg/kg组GSH-Px活力外，投喂7 d时的120和240 mg/kg组的SOD、GSH-Px活力和GSH含量较投喂1 d时差异显著。同时，肝脏mRNA表达量的结果显示，与阴性对照组相比，随着投喂时间的增加，阳性对照和各姜黄素组表达量均值呈不同程度的上升现象。这说明姜黄素可通过调控的表达来上调机体相关抗氧化酶的活力，从而达到维持机体氧化与抗氧化生理平衡以及修复肝脏损伤的目的。

3.3 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏组织结构的影响

通过观察经四氯化碳诱导后鱼体的肝脏组织切片可确定姜黄素对鲤肝脏损伤有否修复作用。结果显示，在四氯化碳诱导初期，鱼体肝脏出现空泡化、细胞核偏移及细胞核聚集等现象。投喂姜黄素7 d时，120 mg/kg组肝脏组织已无空泡化、细胞膨大和细胞核聚集现象，与阴性对照组无明显差异，而阳性对照组和60 mg/kg组肝脏组织仍有细胞核聚集和细胞空泡现象，且240 mg/kg组肝细胞也有轻微空泡化。表明饲料中添加姜黄素对鲤鱼肝脏损伤有一定修复作用。其中，以120 mg/kg姜黄素添加效果最佳。原因可能有以下几点：首先，在肝脏损伤初期，机体产生大量ROS分子，其可导致受损细胞DNA分子损伤，而姜黄素可提高相关抗氧化酶的活力来消除ROS分子；其次，姜黄素作为一种中草药添加剂，其功能或与大黄素通过调节细胞凋亡相关基因修复肝脏损伤[37]类似，但剂量不足或过量使用均不能达到最优效果。

3.4 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏细胞核内Nrf2含量的影响

Nrf2属于碱性亮氨酸拉链蛋白质家族，是包括p45、Nrf1、Nrf2和Nrf3在内的CNC转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，主要在机体的代谢器官和解毒器官（如肝脏）中表达。而Nrf2的活性是由胞浆蛋白伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）精确调控的。在正常的生理状态下，Keap1通过其DGR区结合位点分别与Nrf2和肌动蛋白相结合，从而将Nrf2约束于细胞质中，而当细胞受到外源性化学制剂刺激或者氧化应激时，Keap1或者Keap1的DGR区构象发生变化，进而使Nrf2从Keap1上解离出来，移位至细胞核中，与抗氧化反应元件ARE相互作用，进一步激活了ARE介导下的相关代谢酶基因的表达[38]。本研究中，投喂饲料7 d后，添加姜黄素组鲤肝脏细胞核内Nrf2蛋白含量高于阴性对照组和阳性对照组，其中，以120 mg/kg组核内Nrf2的含量最高。这说明，姜黄素可促使Nrf2从Keap1上解离出来，从细胞质移位至细胞核中，进而参与调控相关抗氧化酶的合成，最终达到修复肝脏损伤和维持机体动态平衡的目的。这与肝脏切片和Nrf2 mRNA表达的结果一致。

4 结论

姜黄素可通过介导Nrf2来提高鲤鱼相关抗氧化酶的活力，从而对鱼体的肝脏损伤进行修复。当姜黄素的添加水平为120 mg/kg时，机体的抗氧化功能最强，对肝脏损伤的修复力也最强。

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Research of Curcumin on Recovery Effect of Liver Injury inInduced by Carbon Tetrachloride

ZHANG Yuan-yuan1, SONG Li-ping1, GUO Hui2, WANG Xiao-li1

（1.,’250013,2.,’250022,）

【】To evaluate the recovery of curcumin in liver injury ofinduced by carbon tetrachloride (CCl4), for future screening of green treatment drugs for the tr fish hepatobiliary syndrome.【】A basal diet supplemented with 0, 60, 120 and 240 mg/kg curcumin as four experimental diets. The experiment included five groups: positive control group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed basic feed), negative control group (injected with olive oil, fed basic feed), 60, 120 and 240 mg/kg curcumin group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed the diet supplemented with 60, 120 and 240 mg/kg curcumin respectively).The activity of GPT, GOT, MDA content, Total Protein (TP) in blood, T-AOC, SOD, GSH, GSH-Px, and expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) were detected, and histological exaination for liver was conducted .【】 By comparing blood physiological indexes (GPT, GOT, TP and T-AOC) and other antioxidant indexes (SOD, MDA, GPx, GSH and Nrf2, et al) among groups at different times, the therapy effect of curcumin to liver injury induced by carbon tetrachloride inwere evaluated. It was found that: during the experiment period, blood physiological indexes and other antioxidant indexes are significantly (<0.05) influenced by the dose and feeding time of curcumin. Initially, there were a significant (<0.05) increase on glutamic oxalacetic transaminase (GOT) and glutamic pyruvictransaminase (GPT) activities of the plasma and liver malondialdehyde (MDA) content in the positive control group and the three curcumin groups, and the mean values of these indexes decreased with increasing feeding time. The activity of GPT, GOT and MDA content of 120 mg/kg group and GPT activity of 240 mg/kg group had a significantly difference(<0.05) with increasing feeding time. In addition, the trend of total protein (TP) and total antioxidant capacity (T-AOC) of plasma and liver superoxidedismutase (SOD), glutathione (GSH) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities were the opposite of that of GPT. T-AOC, SOD and GSH-Px activities and TP and GSH contents of 120 mg/kg group. The activity of SOD and GSH-Px and GSH content of 240 mg/kg group increased firstly and then decreased(<0.05) with increasing feeding time. Curcumin (120 mg/kg curcumin per diet) can repair the damage of liver caused by carbon tetrachloride and restored liver tissue to normal. Results ofmRNA expression in liver and Nrf2 protein level in nucleus also indicated that the dietary supplementation with optimal curcumin could increase themRNA expression in liver and enhance antioxidant status of carp by promoting the release of Nrf2, which increase the activity of antioxidantenzymes and finally protect common carp from liver injury by CCl4.【】Curcumin (especially 120 mg/kg) can improve activities of related antioxidant enzymes through the regulation of Nrf2 activity, so as to repair liver damage in fish.

; liver injury; recoveryeffect; curcumin; Nrf2

S917；S948

A

1673-9159（2020）05-0001-11

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.001

2020-01-04

山东省自然科学基金项目（ZR2018PC030）

张媛媛（1984－），女，博士，助理研究员，从事水产动物营养与免疫研究. E-mail: yyuanzhang2008@163.com

张媛媛，宋理平，郭辉，等. 姜黄素对四氯化碳诱导鲤肝脏损伤的修复作用[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（5）：1-11.

（责任编辑：刘庆颖）