葛根芩连汤发酵液对流感病毒FM1感染模型小鼠的治疗作用

肖奕珂，许华冲，邓力，陈孝银

（暨南大学中医学院，广东广州 510632）

流行性感冒（influenza），简称流感，是由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，经飞沫传播，传染范围广泛[1]。寻找流感病毒治疗的更优方案有重要的研究意义。既往研究表明，葛根芩连制剂能治疗流感[2]，方中葛根、黄芩、黄连、甘草都具有抗病毒作用[3-5]。葛根芩连汤的主要有效成分是葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱[6]。据报道，微生物发酵可增加葛根芩连汤中葛根素、黄芩苷等黄酮类化合物的含量[7-9]。当前研究已发现，部分黄酮类化合物具有抗病毒作用[10]。基于葛根芩连汤含有抗病毒成分，而发酵能增加其抗病毒成分的文献研究背景，本研究拟探讨葛根芩连汤发酵液防治流感的理论基础及葛根芩连汤发酵液对流感小鼠的治疗作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF 级雌性C57BL/J 小鼠32 只，体质量（18±2）g，购置于广东省医学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0002。饲养于暨南大学医学院微生物与免疫学P2 实验室，日光照12 h，温度（22±2）℃，湿度50%。

1.2药物及制备葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、甘草组成，葛根、黄芩、黄连、甘草比例为8∶3∶3∶2[4，7，11]，各中药材购于康美药业股份有限公司。将上述中药材煎煮去药渣后，制备成含生药量为1.0 g·mL-1的溶液，旋蒸，微生物发酵，制成葛根芩连汤发酵液[9，12]。磷酸奥司他韦颗粒，由宜昌东阳光长江药业股份有限公司生产，批号：H20080763。

1.3主要试剂与仪器流感病毒鼠肺适应株（FM1）由暨南大学医学院微生物与免疫学教研室提供，血凝效价1∶16。逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（日本TaKaRa公司）；GAPDH抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；Toll 样受体7（TLR-7）多克隆抗体（美国Bioworld Technology 公司）。T100 梯度 PCR 仪、CFX96 touch 实时荧光定量PCR 仪、PowerPac Basic 电泳系统、Trans-Blot Turbo转印系统、Chemidoc MP 全能型成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.4分组与模型构建将32只小鼠按随机数字表分为空白对照组、模型对照组、西药治疗组、中药治疗组，每组8只。适应性喂养1周后，除空白对照组外，其余各组小鼠均经乙醚轻度麻醉后进行FM1 流感病毒鼠肺适应株滴鼻处理，50 μL/只，连续3 d，建立流感模型[13-14]。

1.5给药方法参照人和动物间体表面积折算的等效剂量比值确定药物剂量[15]。造模结束后，中药治疗组给予葛根芩连汤发酵液（生药剂量为10 g·kg-1）灌胃，西药治疗组给予磷酸奥司他韦（剂量为22.75 mg·kg-1）灌胃，空白对照组及模型对照组给予等体积生理盐水灌胃。共灌胃4 d，每天2次。

1.6观察指标与方法

1.6.1 观察小鼠肺大体形态 给药结束后，脱颈处死，解剖取肺，观察肺大体形态。

1.6.2 病毒血凝实验 取肺组织，研磨匀浆，取25 μL上清，在微量反应板上选好一排孔，按倍比稀释法，从第1孔稀释到第8孔，每孔加入1.2%鸡红细胞悬液25 μL，充分混匀，室温静置45 min，观察反应结果。

1.6.3 RT-PCR 检测小鼠肺组织FM1 mRNA 表达水平 取小鼠肺组织，应用TRIzol试剂盒提取组织总RNA，核酸蛋白定量分析仪测定波长为260 nm、280 nm的吸光度（OD，D）值，根据D（260）/D（280）值，判断RNA 纯度。将纯度合格的总RNA 逆转录合成cDNA，以此为模板，采用SYBR 法进行PCR检测。2-△△Ct法计算肺组织中FM1 mRNA 相对表达水平。PCR反应条件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，循环次数40。FM1 引物序列：上游，5'-GACCAATCCTG TCACCTCTGAC-3'；下游，5'-GGGCATTTGGAC AAACGTCTACG-3'。扩增片段长度240 bp。GAPDH引物序列：上游，5'-TGATGACATCAAGAAGGT GGTGAAG-3'；下游，5'-TCCTTGGAGGCCATGT AGGCAT-3'。扩增片段长度240 bp。

1.6.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测小鼠肺组织TLR-7 蛋白相对表达水平 取肺组织，研磨，离心，提取上清液，即组织总蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度。制备上样样本进行十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），转印，封闭，分别孵育一抗（TLR-7 按1∶1 000稀释；GAPDH按1∶1 000稀释）和二抗，化学发光成像，以Image J 软件分析目标带的净光密度值。

1.6.5 苏木素—伊红（HE）染色法观察小鼠结肠组织病理情况 取3 ～4 mm结肠组织，40 g/L多聚甲醛固定，酒精脱水，透明，浸蜡，包埋，切片及贴片，染色，封片，显微镜下观察。

1.7统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数± 标准差表示，若数据符合正态性及方差齐性，多组比较采用单因素方差分析，否则采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组小鼠肺大体形态变化图1 结果显示：空白对照组小鼠肺组织呈淡粉色。模型对照组小鼠肺组织充血肿胀，呈暗红色。中药治疗组、西药治疗组肺组织局部充血肿胀，较模型对照组减轻，色泽介于暗红与淡粉之间。

图1 各组小鼠肺大体形态变化Figure 1 Comparison of the macroscopic pathological features of lung in various groups

2.2各组小鼠肺组织FM1 mRNA表达水平比较呼吸道标本核酸阳性作为流感确诊的关键指标[1，16]。图2结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织FM1 mRNA 表达水平增高（P＜ 0.05）。表明模型对照组小鼠肺组织病毒核酸高表达，因此确定模型构建成功。治疗后，与模型对照组比较，中药治疗组、西药治疗组小鼠肺组织FM1 mRNA 表达水平下降（P＜0.05），且中药治疗组小鼠肺组织FM1 mRNA 表达水平低于西药治疗组（P＜0.05）。表明葛根芩连汤发酵液能有效降低流感小鼠肺组织病毒核酸高表达，治疗效果优于奥司他韦。

图2 各组小鼠肺组织FM1 mRNA表达水平比较Figure 2 Comparison of the expression level of FM1 mRNA in lung tissue of various groups

2.3各组小鼠肺流感病毒血凝效价比较阴性对照组红细胞呈纽扣状沉淀在底部，证明实验无其他干扰因素。阳性对照，即病毒原液稀释度1∶2 ～1∶16 引起血凝反应，从1∶32 开始即不再发生血凝反应，表明其血凝价为1∶16。表1结果显示，模型对照组肺组织匀浆稀释度为1∶2 ～1∶128 时引起血凝反应，1∶256 开始不再反应，表明其血凝价为1∶128。模型对照组病毒血凝价高于病毒感染原液，说明流感病毒株毒力经鼠肺传染后活性增强。西药治疗组病毒血凝价均在稀释度1∶2 ～1∶8时引起血凝反应，1∶16 开始不再反应，表明其血凝价为1∶8。中药治疗组病毒血凝价均在1∶2 ～1∶16引起血凝反应，1∶32 开始不再反应，表明其血凝价为1∶16。表明葛根芩连汤发酵液治疗可降低小鼠肺流感病毒血凝效价。

表1 各组小鼠肺流感病毒血凝效价比较Table 1 Comparison of the influenza virus hemagglutinin titer in various groups

2.4各组小鼠肺组织TLR-7蛋白相对表达水平比较图3结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织TLR-7 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。与模型对照组比较，中药治疗组、西药治疗组小鼠肺组织TLR-7 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；但与西药治疗组比较，中药治疗组小鼠肺组织TLR-7表达水平升高（P＜0.05）。

图3 各组小鼠肺组织TLR-7蛋白相对表达水平比较Figure 3 Comparison of the relative expression level of TLR-7 protein in lung tissue of various groups

2.5各组小鼠结肠组织病理变化比较图4 结果显示：空白对照组小鼠结肠组织单层柱状上皮细胞排列紧密，大肠腺形态完好，黏膜层、黏膜下层、肌层清晰可见，纹理分明。与空白对照组比较，模型对照组小鼠结肠组织单层柱状上皮细胞排列疏松，大肠腺形态萎缩；中药治疗组、西药治疗组小鼠结肠组织形态与空白对照组相近。

图4 各组小鼠结肠组织病理变化比较（HE染色，×100）Figure 4 Comparison of the pathological features in colon tissue of various groups（by HE staining，×100）

3 讨论

微生物发酵技术在中国已有数千年的历史，《黄帝内经》中“汤液醪醴论”讲述了古人利用微生物发酵将五谷转化成为治病的醪醴[17]，唐朝已有文献论述将中药制成药酒的方法及用途[12]。由《汤液醪醴论》可知：“古人酿五谷为酒，备邪气时至，服之万全。”微生物发酵能延长保存时间，还可以改变药物的性味，增添新的功效。研究葛根芩连汤发酵液对流感的治疗作用有助于开发中药新剂型，延长汤剂的保质时间，降低防腐剂等添加剂的使用，具有实际应用价值。与葛根芩连汤原液相比，发酵液中未出现新的次级代谢产物，生物碱含量稳定，黄芩苷、小檗碱等异黄酮含量增加[9]，黄芩苷[18]、小檗碱[19]可抑制神经氨酸酶活性。基于量效关系[20]，可以认为酵母发酵能增加葛根芩连汤的抗病毒成分，增强治疗作用。发酵使大分子多糖类成分减少，增加了小分子糖含量[21]。与大分子多糖不同，小分子糖不仅具有免疫调节功能，还能促进双歧杆菌生长，抑制大肠杆菌生长[22]。肠道菌群失调是流感病情加重的原因之一[23]。与大分子多糖相比，小分子糖类可能更有利于肠道菌群恢复稳态。本研究结果显示，葛根芩连汤发酵液能有效降低流感小鼠肺组织病毒核酸的高表达，治疗效果优于奥司他韦。

天然免疫应答是机体抵御微生物感染的第一道防线。Toll样受体家族在机体天然免疫对病原体的识别方面发挥着非常重要的作用[24]。其中TLR-7可以识别病毒ssRNA，启动MyD88 依赖的信号通路，激活核因子NF-κB，进而引起白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）等促炎症因子和I 型干扰素的产生，介导机体抗病毒免疫应答[25]。本研究结果显示，葛根芩连汤发酵液可使流感小鼠肺组织TLR-7 表达下调，表明葛根芩连汤发酵液可能通过抑制TLR-7表达在流感治疗中发挥抗炎作用。

流感为上呼吸道感染，病位在肺[1]，中医认为：“肺与大肠相表里，肺病可以治肠。”[26]葛根芩连汤主治阳明里热，病位在肠[27]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠结肠组织单层柱状上皮细胞排列疏松，大肠腺形态萎缩。中药治疗组、西药治疗组小鼠结肠组织形态的与空白对照组相近。保护小鼠肠道组织结构形态的完整可能是葛根芩连汤发酵液治疗流感的原因之一。

综上所述，葛根芩连汤发酵液对流感模型小鼠具有治疗效果，可抑制肺组织病毒核酸表达，抑制肺组织TLR-7 蛋白表达，维持肠正常生理组织结构形态稳定。

本实验仍存在以下不足：（1）尚未能探明葛根芩连汤发酵液治疗流感的“肺与大肠相表里”的内在机制；（2）尚未能探明葛根芩连汤发酵液治疗流感小鼠的主要原因是其黄酮类成分的抗病毒作用，还是辅助免疫系统通过调节免疫细胞达到清除病毒的治疗效果。但可为后续研究指明研究方向。在后续研究中将探讨葛根芩连汤发酵液对TLR-7 信号通路及其介导的细胞因子的影响，以进一步阐明其抗肺炎病毒机制。