基于网络药理学探讨三七对骨愈合的作用机制

吴文正，郑晓辉，高怡加，欧阳崇志，黄敏玲，杨锐敏

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

在骨科研究领域中，怎样促使骨愈合一直是一个难题[1]。影响骨愈合的因素很多，包括全身性因素、局部因素和治疗因素。在骨修复领域，各学科包括组织学、生物学、分子生物学、生物材料学等采取了一系列相关措施和方法来促进骨愈合[2]，而中医药在促进骨愈合方面具有明显的优势[3]。三七是临床治疗骨伤的常用中药，具有活血、止痛、止血、消肿等功效[4-5]。现代药理学研究表明，三七可显著增加骨折骨痂的骨量和骨密度，促进骨愈合[5]，其相关活性成分可改善血液流变性和骨折部位的血供，促进成骨细胞形成、分化和矿化，从而有利于骨愈合[4，6-8]。但由于中药具有成分多样性及其对机体作用机制的复杂性，对于三七促进骨愈合的作用机制尚未完全明确。利用网络药理学技术构建多层次网络模型，从整体角度对中药进行研究，已成为一种科学解释中药有效性和科学性的新策略[9-10]。因此，本研究基于网络药理学的方法，探讨三七对骨愈合的作用机制，以期为进一步的实验验证提供依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1三七的化学成分及作用靶点的预测TCMSP（网址：http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）是一个整合了药物代谢动力学、药物化学和药物—靶标蛋白网络—疾病网络的中药系统药理学数据库和分析平台[11]。TCMSP具有识别药物靶点网络和药物疾病网络的能力，这有助于揭示中草药的作用机制，揭示中医理论的本质，开发新的以草药为导向的药物[12]。UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org）是一个可以提供稳定、全面的蛋白质序列和功能注释并可免费访问的资源中心[13]。本研究通过检索TCMSP 获得三七的化学成分，筛选出符合条件[口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和类药性（drug-likeness，DL）＞ 0.18][11]的候选化学成分及其对应靶点，再借助UniProt 数据库查询靶点对应基因名的简称。

1.2骨愈合相关靶点及其与药物靶点交集的获取以“bone healing”为检索词，在GeneCards（网址：https：//www.genecards.org）数据库和OMIM（网址：https：//omim.org）数据库中搜索骨愈合的相关靶点，并取其与“1.1”项所获得的三七相关作用靶点的交集，提取整理三七—骨愈合交集靶点。

1.3“三七化学成分—作用靶点—骨愈合”网络的构建与分析利用Cytoscape 3.7.1 软件构建化合物—靶点（基因）网络，通过软件中的“Network Analyzer”功能对三七化学成分和作用靶点间的度（Degree）值进行分析。根据化学成分与靶点连接情况筛选出三七作用于骨愈合的关键化合物。

1.4蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建及其核心靶点的筛选将“1.2”项中的三七—骨愈合交集靶点导入STRING 11.0在线数据库（网址：https：//string-db.org），将研究物种设置为“Homo sapiens”，从而得到三七作用于骨愈合的PPI网络。利用R语言软件（版本3.6.1）对获得的PPI网络数据进行处理分析获得关键靶点并作图。

1.5基因本体论（GO）功能富集分析及基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将三七—骨愈合交集基因导入DAVID 6.8 数据库（网址：https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），输入靶基因名称列表，限定物种为“Homo sapiens”，将靶基因名修正为官方名称（official gene symbol），设定阈值P＜0.05，进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，并用利用R 语言软件（版本3.6.1）对其分析结果进行可视化。

2 结果

2.1三七化学成分及作用靶点的筛选结果从TCMSP 平台中检索三七的化学成分，并以OB ＞30%，DL ＞0.18 为条件，共筛选出化学成分8 个。再从TCMSP 平台中检索三七的作用靶点，根据选出的化学成分筛选出对应的靶点，其中1个候选化学成分无作用靶点，共得到不重复的靶点89个。

2.2骨愈合相关靶点获取及三七—骨愈合交集靶点的整理在GeneCards 和OMIM 数据库中检索“bone healing”，共得到3 622个骨愈合的相关靶点基因，与“2.1”项中所获三七作用靶点取交集后，获得三七—骨愈合交集靶点70个。

2.3“三七—化学成分—作用靶点—骨愈合”网络及分析结果通过Cytoscape 3.7.1 软件构建“三七—化学成分—作用靶点—骨愈合”网络，见图1。化学成分中，Degree值最高者为槲皮素（quercetin），其 次 为 β- 谷 甾 醇（beta- sitosterol）、 豆 甾 醇（stigmasterol）、人参皂苷Rh2（ginsenoside rh2），食脂素（DFV）、十八碳二烯（mandenol）、邻苯二甲酸二异辛酯（diop），其所对应的作用靶点分别为64、11、9、4、2、2、1 个。其中，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷Rh2 可能是三七发挥促进骨愈合作用的关键化学成分。

图1 “三七—化学成分—作用靶点—骨愈合”网络Figure 1 “Radix Notoginseng-chemical constituents-targets-bone healing”network

2.4 PPI网络的构建及核心靶点的筛选将70 个三七—骨愈合交集靶点导入STRING 11.0在线数据库行PPI网络构建，见图2。图中共包含70个节点（表示相关蛋白），602 条边（表示蛋白与蛋白之间的相互作用）。发生蛋白相互作用的靶点有68 个（2 个靶点未发生蛋白相互作用）。将PPI 网络数据导入R 语言软件（版本3.6.1），根据Degree 值筛选出排名前30位的节点，见图3。这些节点对应的靶点可能是三七作用于骨愈合的关键靶点。

图2 三七—骨愈合交集靶蛋白PPI 网络图Figure 2 PPI network diagram of intersection target protein between Radix Notoginseng and bone healing

图3 Degree 值排名前30位的靶点Figure 3 Targets for the top 30 Degrees

图4 三七—骨愈合交集基因GO功能富集分析结果Figure 4 GO functional enrichment analysis results of the intersection genes of Radix Notoginseng-bone healing

2.5 GO功能富集分析将70 个三七—骨愈合交集基因导入DAVID数据库，通过GO功能富集分析得到GO 条目284个（P＜ 0.05），其中207个生物过程（biological process，BP）条目，25 个细胞组成（cellular component，CC）条目，52 个分子功能（molecular function，MF）条目，分别选取P值排名前20位作可视化展示，见图4。其中：生物过程主要包括对雌二醇的反应（response to estradiol）、RNA聚合酶II启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、DNA 模板转录的正调控（positive regulation of transcription，DNA-templated）、老化（aging）、缺氧的反应（response to hypoxia）、凋亡过程负调控（negative regulation of apoptotic process）、药物反应（response to drug）、对乙醇的反应（response to ethanol）、凋亡过程（apoptotic process）等；细胞组成方面主要包括细胞质基质（cytosol）、细胞外间隙（extracellular space）、核质（nucleoplasm）、膜筏（membrane raft）、 细 胞 核（nucleus）、 细 胞 质（cytoplasm）等；分子功能主要为酶结合（enzyme binding）、 相 同 的 蛋 白 结 合（identical protein binding）、 转 录 因 子 结 合（transcription factor binding）、蛋白结合（protein binding）、蛋白质异二聚化活性（protein heterodimerization activity）等。

图5 三七—骨愈合交集基因KEGG通路富集分析结果Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis results of the intersection genes of Radix Notoginseng-bone healing

2.6 KEGG通路富集分析通过对70个三七—骨愈合交集靶点的KEGG通路富集分析发现，三七作用于骨愈合主要涉及66条通路（P＜0.05）。筛选出其中富集基因数居前30 位的通路，并作可视化展示，见图5。其中主要涉及肿瘤、乙型肝炎、人类T细胞白血病病毒感染、甲型流感、军团菌病、结核病、弓形虫病、病毒性心肌炎等人类疾病通路，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶3（PI3K-Akt）信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、钙信号通路、Ras 信号通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路等环境信息处理通路，甲状腺激素信号通路、催乳激素信号通路等有机系统通路，细胞局部粘附、p53信号通路、细胞凋亡等细胞过程通路。由此可见，三七可以通过上述多条信号通路作用于骨愈合。

3 讨论

本研究基于网络药理学的方法，通过相关数据库和软件，探讨了三七对骨愈合的作用机制。研究发现三七主要作用于骨愈合的的主要化学成分为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷Rh2等。既往研究表明，槲皮素能够通过上调骨形态发生蛋白（BMP）2 和Smad4基因的表达，从而促进成骨分化[14]；β-谷甾醇可通过提高成骨细胞护骨素/破骨细胞分化因子（OPG/ODF）的比值从而促进和加强成骨作用[15]；人参皂苷Rh2 可能通过下调NFATc1、c-Fos从而抑制破骨细胞的分化[16]；而目前关于豆甾醇与骨愈合之间的研究较少，这为进一步的实验探讨提供了新方向。

通过构建PPI并分析出三七作用于骨愈合的关键靶点主要为IL6、CASP3、EGFR、VEGFA、MYC、ESR1 等，其对应的Degree 值分别为49、45、44、43、41、40。这表明三七对骨愈合的作用机制呈多成分、多靶点的特点。

本研究对三七—骨愈合交集靶点进行KEGG富集通路分析发现30 条通路与三七作用于骨愈合显著相关。所筛选出来的通路中，富集基因数最多的为人类疾病通路，但人类疾病相关通路多较为复杂，常包括多个下游通路，如肿瘤信号通路的下游通路包括PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、钙信号通路、VEGF 信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路等，乙型肝炎通路的下游通路包括PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、p53 信号通路、Ras 信号通路等。所筛选的环境信息处理通路中，PI3KAkt信号通路是十分重要的有丝分裂信号通路，在细胞生长、存活、增殖和运动各种细胞过程中发挥着基本作用[17]。已有研究报告了PI3K信号的关键调节功能及其在骨形成和重塑中的下游目标[18-19]。也有研究发现，bFGF 可通过激活PI3K/Akt 信号通路促进OPG、Runx2、p-Akt 和BMP2 蛋白的表达以及钛表面成骨细胞的增殖、分化和成骨[20]。骨是一种高度血管化的组织[21]，骨修复和再生的进展与血管生长密切相关。低氧诱导因子（HIF）是在血管生成、红细胞生成、能量代谢和细胞命运决定中发挥重要作用的氧依赖性转录激活因子。研究发现，HIF-1α 及其靶基因是血管生成—成骨偶联中的关键调节因子[22]。软骨细胞、成骨细胞和间充质干细胞通过HIF信号通路感知降低的氧张力，在骨修复和再生过程中传递与血管生成和成骨基因程序相关的信号[23]。此外，Wnt 信号通路、Notch 信号通路、MAPK 信号通路、钙信号通路、VEGF 信号通路等也均为参与骨再生的重要信号通路[24-25]。所筛选的有机系统通路中，已有研究证明甲状腺激素信号通路在骨骼生长调控中起着关键的作用，甲状腺激素通过调节软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等其他类型骨细胞和调控胰岛素样生长因子1（IGF-1）、Wnt、甲状旁腺相关蛋白（PTHrP）和成纤维细胞生长因子（FGF）等关键的生长因子信号通路来调节骨的生长[26-27]。催乳素在一定浓度范围（0.01 ～ 10.0 μg/mL）内抑制体外培养奶牛成骨细胞的增殖和分化[28]。本研究所筛选的细胞过程通路中，细胞局部粘附对于细胞运动、细胞增殖、细胞分化、基因表达调节和细胞存活等生物过程起重要作用，如黏着斑激酶（FAK）的激活需要通过细胞局部粘附通路，其对于BMP 发挥出刺激成骨细胞标志物的作用而言是必不可少的[29]。p53 信号通路与骨量、骨质疏松、骨折愈合密切相关，在骨重塑中发挥着重要作用[30]。研究发现，Ccnb2 和Rrm2 调节因子可能是通过激活p53 信号通路从而抑制骨质疏松小鼠的骨愈合[31-32]。

综上所述，三七对骨愈合的作用机制呈多成分、多靶点、多通路的特点，主要通过肿瘤疾病通路、PI3K-Akt 信号通路、甲状腺激素信号通路、细胞局部粘附等多方面的途径发挥调节骨愈合的作用，这为进一步深入探讨其作用机制指明了方向，有待动物实验加以验证。