2018年江苏省人感染布鲁氏菌分离株分子特征分析

谈忠鸣，汪秀斌，周伟忠，董 晨，周 璐，洪 捷，钱慧敏，胡建利，鲍倡俊

布鲁氏菌病(简称布病)是一种由布鲁杆菌引起的人兽共患的传染病，人主要通过接触患病的牲畜或污染物感染发病。我国以羊种布鲁氏菌感染为主，国外以牛种布鲁氏菌为主[1]。布病可以表现为局部脓肿，可引起患者全身多系统的损害，对骨关节的损害较多。患者主要表现为发热(多为弛张热)、多汗、全身乏力、关节痛和肌肉疼痛，病情严重时可丧失劳动能力，如不及时治疗，易转为慢性，增加治愈难度。目前发现的布鲁氏菌已有10个种(Brucellamelitensis，Brucellaabortus，Brucellasuis，Brucellaovis，Brucellaneotomae，Brucellacanis，Brucellamicroti，Brucellaceti，Brucellapinnipedialis，Brucellainopinata)[2]，感染人的布鲁氏菌主要以羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)及猪种(B.suis)为主[3]。

布病在全国所有省份都有病例报告，主要集中在新疆、河北、内蒙古、吉林、黑龙江、辽宁等北方地区。布病患者往往是因为接触患病动物感染，所以由于其所从事的工作而感染情况较多，比如养殖厂工人、兽医、屠宰加工人员、奶制品和皮毛加工人员等(简称布病职业人员)。江苏省为布病非流行区[3]，2005年报道首例病例后，2005-2011年布病累计报告病例数开始缓慢上升，2012年后布病疫情明显呈上升趋势。至2014年疫情已扩散至全省所有省辖市并呈现逐年高发趋势。

AMOS-PCR可以鉴别鉴别牛种、羊种及猪种布鲁氏菌的多重PCR方法[4]。多位点序列分析(Multilocus sequence analysis, MLSA)是一种基于以核苷酸序列为基础，通过对9个管家基因进行测序，比较不同样本的等位基因多样性。它是高通量测序技术与成熟的群体遗传学相结合的产物，简单易行，重复性好，可以通过国际互联网对某一病菌株在全球范围内的传播情况进行追踪监测[5]。多位点串联重复序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)是利用细菌基因组中不同等位基因中串联重复序列的拷贝数多少来进行基因分型的技术。MLVA具有较高的灵敏度和特异性，并且具有快速、准确、重复性好的特点，可在全球范围内进行实验室数据交流与共享，用于基因分型研究及突发事件中病因的溯源，两种方法在全球的布鲁氏菌病的流行病学研究调查中起到重要的作用[6]。

为进一步预防控制江苏省布鲁氏菌的感染，本研究运用AMOS-PCR、MLSA、MLVA 3种分子分型方法对2018年收集的人间布鲁氏菌进行特征分析。

1 材料与方法

1.1菌株来源 通过哨点医院收集2018年全省人感染布鲁氏菌菌株。分离纯化菌株接种在含5%羊血平板上，注意无菌操作，四区划线，放置37 ℃培养箱中孵育过夜。同时对各医院上报的布鲁氏菌病患者进行流行病学资料收集。

1.2试剂与仪器 Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成，QIAamp DNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)，TaKaRa Mini Best Agarose Gel DNA Extraction Kit(宝日医生物技术(北京)有限公司)。梯度PCR仪(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)、毛细管电泳仪(Qiagen, Hilden, Germany)，Applied Biosystems/HITACHI 3500xL一代测序仪(Hitachi High-technologies Corporation, Tokyo, Japan)。

1.3核酸的提取 用接种环刮取细菌加入含200 μL无菌生理盐水的E-P管中。采用QIAamp DNA mini kit试剂盒提取DNA，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书进行，核酸-80 ℃保存待用。

1.4AMOS-PCR 根据插入序列IS711分别在牛、羊、猪3个种型的基因组中插入位置的差异，可以根据PCR扩增产物的大小来鉴别3种布鲁氏菌[4]。反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，H2O补足20 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃总延伸7 min。PCR产物经毛细管电泳分析后，直接记录PCR产物大小。

1.5MLSA 多位点序列分析方法通过对布鲁氏菌管家基因进行测序分析，研究该菌的遗传和进化[5]。对布鲁氏菌9个管家基因(gap，aroA，glk，dnaK，gyrB，trpE，cobQ，omp25及int-hyp)进行扩增，扩增条件：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃总延伸5 min。MLSA产物用TaKaRa试剂盒回收后上机测序。

1.6MLVA 根据文献报道[6]，对布鲁氏菌的3组(panel 1、panel 2A、panel 2B)16个等位基因(panel 1：Bruce06，Bruce08,Bruce11,Bruce12，Bruce42，Bruce43，Bruce45 and Bruce55；panel 2A：Bruce18，Bruce19 and Bruce21；panel 2B：Bruce04，Bruce07，Bruce09，Bruce16 and Bruce30)进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；最后72 ℃总延伸5 min。PCR产物经毛细管电泳分析后，记录PCR产物大小。

1.7数据分析 测序结果用Lasergene软件包和MEGA 4.1软件进行编辑[7]。确定9个等位基因序号构成的基因型(Sequence Type，ST), 并用eBURST软件与数据库内国际参考株的ST型进行聚类分析。MLVA序列分析出每株菌16个等位基因的串联数后，将串联数做为字符型数据导入BioNumerics 5.1(Applied Maths, Belgium)软件，利用非加权配伍组平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)进行聚类分析。

2 结 果

2.1地区分布 通过大疫情网收集全省布病病例数据，通过致病菌识别网收集布鲁氏菌株。2018年江苏省报告病例数共175例(省内病人141例，省外病人在我省就医的有34例)。江苏省病例最多的5个市分别为徐州(49例)、连云港(21例)、南通(18)、南京(13例)和苏州(11例)；全年收集菌株56株，分离最多的5个市为连云港(16株)、南通(16株)、徐州(5株)、苏州(4株)和盐城(4株)。

2.2AMOS-PCR 所有菌株培养提取核酸后进行核酸检测，PCR产物经毛细管电泳分析后显示，除1株菌(JS-2018-61)结果为阴性，其余均为羊种布鲁氏菌(310 bp)，见图1。

图1 羊种布鲁氏菌毛细管电泳分析图Fig.1 Capillary electrophoresis diagram of PCR products from Brucella melitensis

2.3MLSA分型 对所有菌株进行MLSA分析，PCR产物测序后与MLSA数据库基因序列比对，确定JS-2018-61为猪种ST17型(1-6-4-1-5-3-5-2-4)，其余均为羊种ST8型(3-2-3-2-1-5-3-8-2)。

ST8型和ST17型的9个等位基因型做为字符型数据导入eBURST软件，并与数据库内已有的35种ST型数据进行聚类分析，运算方法为非加权配伍组平均法(UPGMA)。聚类图显示ST17与ST18、ST20、ST21型聚在同一簇中，ST8型与ST7、ST9、ST10、ST11、ST12、ST34及ST35型聚在同一簇中，见图2。

图2 布鲁氏菌全部35个ST型聚类eBURST图Fig.2 The eBURST diagram of population snapshot by Brucella spp. 35 sequence types

2.4MLVA分析 本研究对分离到的布鲁氏菌株的16个MLVA基因进行PCR扩增，毛细管电泳分析PCR产物大小(图3)。确认所有等位基因的串联数后，做为字符型数据BioNumerics 5.1软件UPGMA算法进行聚类分析，见图4。

MLVA将江苏省2018年收集的56株布鲁氏菌分离株分为47个基因亚型(46个羊种型，1个猪种型)。猪种布鲁氏菌与羊种布鲁氏菌存在较大差异(基因型相似度只有30%)，羊种布鲁氏菌主要分为2个分支，其中一簇JS-2018-19、JS-2018-10、 JS-2018-21、JS-2018-63主要分布于连云港和徐州。另簇分离株分布于其他地区，两分支基因型相似度为70%(14/16)。 江苏分离株JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38为同一基因型。JS-2018-14和JS-2018-18，JS-2018-7和JS-2018-31，JS-2018-28和JS-2018-47，JS-2018-13和 JS-2018-44，JS-2018-10和JS-2018-30，JS-2018-42和 JS-2018-43分别为同一基因型，其他均为独立的基因型。

图3 布鲁氏菌MLVA-16 PCR扩增产物毛细管电泳分析图

图4 2018年江苏省布鲁氏菌MLVA聚类图Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping relationships of Brucella spp. isolates from Jiangsu Province in 2018

3 讨 论

近几年，随着贸易的发展，布病流行越来越严重。江苏省2005年开始陆续报道感染布病病例，2005-2011年布病累计报告病例数仅55例[8-10]，2012年以后江苏省布病疫情明显呈上升趋势，至2014年疫情已扩散至全省所有省辖市并呈现逐年高发趋势，2017年江苏省共报告布病195例，全省报告发病率0.24/10万，较2016年发病率上升36.97%，无死亡病例报告。

江苏省2018年布病的流行病学特征显示全年均可发布发病，夏季高发，冬季发病较少，夏季高发的原因可能与徐州地区的伏羊节有关。2018年全省年发病率前3的地区分别为徐州、连云港和南通，均为江苏中北部地区。布病患者往往是因为接触患病动物感染，因此从事相关工作的职业人群感染情况较多。江苏省病例以男性为主，且30～70岁的农民居多[9-10]，可能与该省饲养牲畜主要以散养方式为主，多为男性在从事相关活动，养殖方式缺乏专业知识和规范化的管理，无防护意识增加了感染布病的风险。

根据插入序列IS711分别在牛、羊、猪3个种型的基因组中根据插入位置的差异设计的AMOS-PCR方法[11]，可同时鉴别感染人的3种布鲁氏菌，并在敏感性和特异性上均高于传统方法。但本研究结果显示，猪种布鲁氏菌检测结果为阴性，说明该方法无法鉴定所有生物型的猪种布鲁氏菌，存在一定的局限性。

MLSA研究发现江苏省布鲁氏菌病以羊种ST8型为主，与历年相同[12-13]，但今年首次发现我省人感染猪种布鲁氏菌ST17型，该型也是我国目前猪种布鲁氏菌的主要流行ST型[14]，说明江苏省出现其他种型布鲁氏菌输入的现象。

MLVA发现羊种布鲁氏菌全部为“东地中海簇”，与国内报道相同[15]。流行病学调查发现所有病例均为散发病例，但根据MLVA结果分析发现部分分离株具有相同基因型，其中JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38为同一基因型，其中JS-2018-22发现于泰州，JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38分离自南通，这两个地区相邻，JS-2018-22为待业人员，JS-2018-24和JS-2018-35 为农民，JS-2018-38在山羊市场工作，这4人存在潜在联系。

本研究揭示了江苏省2018年人间布鲁氏菌的主要流行株的种型和基因型，为将来疫苗株的筛选生产提供了主要方向[16]，并通过MLSA和MLVA 2种分子分型技术确认了江苏省首例人感染猪种布鲁氏菌。同时也暴露出随着经济的发展，与之相配的制度体系不够完善，使疫情防控更加困难，应加强牲畜检验检疫及执行力度，优化免疫补助机制，完善扑杀补助政策。

利益冲突：无