铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF最佳免疫剂量研究

宫 强, 阮梦蝶，郭洁真，杜珍奇

铜绿假单胞菌是一种临床常见的条件致病性人兽共患病原菌。该菌感染人后可引起肺炎、脑膜炎及尿路感染等多种疾病[1-2]。此外，该菌还可导致禽类、水貂等多种动物发生出血性肺炎及败血症等[3]。目前该菌引起的相关疾病的发病率呈现上升的趋势[4]，给人类和养殖业的健康发展带来了一定的威胁。对于该病的防治临床上主要采用药物治疗，尤其是抗生素效果较好，但随着抗生素的大量应用，该病原菌的耐药性问题日益严重，已对多种抗生素产生了较为严重的耐药性[5-7]。因此急需寻求更加有效的措施来控制该病原菌。

众所周知，免疫预防是控制传染病的重要举措。目前不乏有关于铜绿假单胞菌疫苗的研究报道，然而临床上仍无可用的商品化疫苗[8]，因此，铜绿假单胞菌新型疫苗的研制势在必行。DNA疫苗自上世纪90年代问世以来，因其具有制备简单、易于保存等优点而备受研究者的关注。本课题组前期以铜绿假单胞菌的oprL和oprF基因构建了单价、二价融合和二价组合DNA疫苗，研究了其在鸡和小鼠体内的免疫效果，结果均显示二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF可为实验动物提供较好的免疫应答和保护效果[9-10]。基于此，本实验对该组合DNA疫苗设置了不同的免疫剂量，并评估了各剂量在小鼠体内诱导的免疫应答水平和为小鼠提供的保护效果，为进一步优化该组合DNA疫苗的接种程序奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1菌种、质粒与动物 铜绿假单胞菌购自中国兽医药品监察所。真核质粒pcDNA3.1(+)为本实验室保存。健康的6～8周龄 BALB/c小鼠购自河南科技大学医学技术与工程学院。

1.2主要试剂 羊抗鼠HRP-IgG为诺唯赞生物科技公司产品；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA连接酶为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；小鼠IL-2和IFN-γ ELISA检测试剂盒为上海源叶生物科技有限公司产品。

1.3DNA疫苗的构建 按照前期的方法构建DNA疫苗，PCR扩增铜绿假单胞菌的oprL和oprF基因，以限制性内切酶EcoRⅠ/BamHⅠxia酶切后连接pcDNA3.1(+)，转化入大肠杆菌感受态细胞中，随后挑菌提质粒并进行酶切鉴定，重组质粒分别命名为pOPRL和pOPRF，将两者以等浓度等比例混合后获得二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF。

1.4小鼠免疫 健康的6-8周龄 BALB/c小鼠共210只饲养于动物房中，给予合适的光照、温度、湿度和自由饮食，待其适应环境后随机平均分为6组，每组35只小鼠，分别命名为 25 μg组、50 μg组、100 μg组、200 μg组、pcDNA3.1(+)组和PBS组。大量制备pOPRL+pOPRF以及空载体pcDNA3.1(+)，以pH 7.2的1×PBS调整至1 μg/μL后进行免疫。各疫苗组的小鼠分别给予肌肉免疫相应剂量的pOPRL+pOPRF疫苗，空载体pcDNA3.1(+)组和PBS组的每只小鼠则分别予以肌肉注射100 μL的pcDNA3.1(+)和pH 7.2的1×PBS。各组小鼠均进行3次免疫，每次间隔2周。

1.5血清特异性抗体的测定 从第1次免疫后1周时开始对各免疫组的小鼠进行断尾采血，离心分离血清后以间接ELISA法测定血清特异性抗体水平，总共检测6周。以提取的铜绿假单胞菌的外膜蛋白为抗原包被酶标板，包被浓度为20 μg/mL。随后以5%的BSA封闭2 h，再加入1∶100稀释的待测血清，37 ℃反应1.5 h。再经PBST洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG，反应1.5 h后加入OPD在暗室中显色10 min，以2 mol/L的硫酸终止反应，酶标仪测定OD492nm的值。

1.6免疫小鼠脾淋巴细胞增殖分析 每次免疫2周后按文献方法制备免疫小鼠的脾淋巴细胞悬液，MTT法测定其增殖水平[11]。每组取5只小鼠，脱颈处死后无菌分离制备脾淋巴细胞悬液，将细胞浓度调整为1×107个/mL。取50 μL脾淋巴细胞悬液加于96孔细胞培养板中，并设阴性对照。随后向试验孔中加入20 μg/mL的铜绿假单胞菌的外膜蛋白50 μL，阴性对照孔则加入50 μL的细胞培养液。将细胞培养板放置于CO2培养箱中反应72 h后取出，然后向每个反应孔中加入10 μL 5 mg/mL的MTT，继续放置于在CO2培养箱中培养3 h。培养结束后离心弃掉上清液，然后向每孔中加入150 μL的 DMSO，在37 ℃培养箱内放置10 min后测定OD570 吸光值，按下述公式计算刺激值(SI)=OD(试验孔)/OD(阴性对照孔)。

1.7细胞因子分泌水平测定 每次免疫后2周时按照上述方法制备各免疫组小鼠的脾脏淋巴细胞悬液，用铜绿假单胞菌外膜蛋白刺激后在5%的CO2培养箱中孵育72 h，离心后取培养上清液，以小鼠IFN-γ和IL-2检测试剂盒测定2种细胞因子的浓度。

1.8攻毒实验 3免2周后以铜绿假单胞菌强毒菌株对各免疫组剩余的20只小鼠进行腹腔攻毒，攻毒后继续饲养观察15 d，每天记录小鼠死亡情况，实验结束后根据各组的死亡情况绘制小鼠的存活曲线，并计算各免疫组的保护率。

1.9统计学分析 采用SAS 9.4统计学软件进行数据分析，各免疫组间比较采用单因素方差分析，检验水准α为0.05。

2 结 果

2.1重组质粒pOPRL和pOPRF的鉴定 PCR扩增铜绿假单胞菌的oprL和oprF基因，连接真核载体pcDNA3.1(+)后以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，如图1所示，经酶切后获得大小约为517 bp和1 063 bp的DNA片段，表明重组质粒pOPRL和pOPRF构建成功。

M为 DNA Marker DL2000， A-1和B-1分别为pOPRL和pOPRF双酶切鉴定结果图1 重组质粒pOPRL和pOPRF双酶切鉴定Fig.1 Electrophoresis of the two enzymes digestion of pOPRL and pOPRF

2.2免疫小鼠血清抗体水平 间接ELISA测定各免疫组小鼠血清抗体水平，结果如图2所示。随着免疫次数的增加，各剂量组免疫小鼠的血清特异性抗体水平均逐渐上升，且高于两对照组(F=15.326，P<0.01)。2免和3免后，100 μg和200 μg免疫组的血清抗体水平高于25 μg和50 μg免疫组(F=8.139，P<0.05)，但100 μg和200 μg免疫组之间无统计学差异(F=1.662，P>0.05)。

图2 各免疫组小鼠血清抗体水平检测结果Fig.2 Dynamic changes of serum antibody levels in vaccinated mice

2.3脾淋巴细胞增殖检测结果 每次免疫2周时制备免疫小鼠脾淋巴细胞，以铜绿假单胞菌外膜蛋白进行诱导后，MTT法测定其增殖情况。如图3，免疫后各剂量二价组合DNA疫苗组的SI值始终高于pcDNA3.1(+)组和PBS组(F=13.477，P<0.01)。初次免疫后各剂量组的SI之间无统计学差异(F=0.862，P>0.05)，2免和3免后100 μg和200 μg免疫组的SI值则与25 μg和50 μg免疫组之间呈现出明显的差异(F=7.419，P<0.05)。虽然2免和3免后100 μg组的SI值稍高于200 μg组，但差异无统计学意义(F=1.107，P>0.05)。

图3 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平Fig.3 Splenic lymphocytes proliferation in vaccinated mice

2.4细胞因子检测结果 每次免疫2周时制备铜绿假单胞菌外膜蛋白刺激的脾淋巴细胞悬液，测定其分泌的IFN-γ和IL-2的浓度。如图4所示，每次免疫后各免疫剂量组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2的浓度始终高于两组对照组(F=17.355，P<0.01)。第一次免疫后，各剂量组分泌的IFN-γ和IL-2的量无统计学差异(F=0.751，P>0.05)，而2免和3免后100 μg和200 μg免疫组两种细胞因子的浓度明显高于25 μg和50 μg免疫组(F=9.684，P<0.05)，且在3免后100 μg组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2高于200 μg免疫组(F=6.375，P<0.05)。

图4 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ(A)和IL-2(B)浓度Fig.4 Concentrations of IFN-γ (A) and IL-2 (B) from spleen lymphocytes of vaccinated mice

2.5动物攻毒试验结果 第3次免疫后以铜绿假单胞菌强毒株进行攻毒，记录各组小鼠的死亡时间。如图5所示，攻毒后pcDNA3.1(+)组和PBS组的小鼠迅速死亡，存活时间均未超过5 d。25 μg和50 μg免疫组的小鼠在攻毒后第2 d开始出现死亡，至第15 d时其存活数分别为7只和9只。100 μg和200 μg免疫组的小鼠在攻毒后第3 d出现死亡，分别于攻毒后第5 d和第6 d开始死亡数量不再增加，保持为17只和14只。因此，25 μg、50 μg、100 μg和200 μg的铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF为小鼠提供的保护率分别为35%、45%、85%和70%。

图5 攻毒后各组小鼠存活情况Fig.5 Survival curve of vaccinated mice after challenge

3 讨 论

铜绿假单胞菌是一种可导致人类和多种动物疾病的常见人兽共患病原菌，由于其耐药性的日益严重和可用商品化疫苗的缺乏给该病原菌引起的相关疾病的临床治疗带来了巨大的挑战，因此需加大对该病原菌有效疫苗的研究开发。目前国内外对于其相关疫苗的研究不在少数，包括灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、结合疫苗等在内的都有相关研究报道[12-16]。本课题组前期以铜绿假单胞菌的oprL和oprF基因构建了多种DNA疫苗，动物实验结果显示二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF具有较好的应用前景，为进一步提高其免疫效果，本实验对其最佳免疫剂量进行了探索。

抗体应答在抗感染免疫中发挥着重要的作用，本实验检测了各剂量的pOPRL+pOPRF诱导的血清抗体水平，结果表明高剂量的二价组合DNA疫苗诱导体液免疫应答的能力优于低剂量。除抗体应答外，本实验也对各剂量DNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平进行了检测，淋巴细胞增殖试验和细胞因子分泌试验是衡量细胞免疫水平较为常用方法[17]。本实验以铜绿假单胞菌外膜蛋白为特异性刺激物用以诱导各免疫组小鼠的脾淋巴细胞，与抗体检测结果相似，高剂量组免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖能力优于低剂量组。本实验的前期研究显示二价组合DNA疫苗可诱导较强的Th1型免疫应答，而其诱导的Th2型免疫应答并不优于单价DNA疫苗和二基因融合DNA疫苗[9]。因此，本实验仅对不同剂量的pOPRL+pOPRF诱导的Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2进行了测定，结果表明当免疫剂量为100 μg时其诱导免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2浓度高于其他各剂量组。攻毒实验结果亦显示100 μg的pOPRL+pOPRF可为小鼠提供高于其他剂量的保护效果。因此，本实验研究结果表明铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫效果及为小鼠提供的保护效果与免疫剂量有一定的相关性，但并非越高越好，对小鼠而言最佳免疫剂量为100 μg/只。

利益冲突：无