环介导等温扩增法检测人粪样中美洲钩虫的方法建立

危芙蓉，朱慧慧，贾孝凯，汪俊云

钩虫是3种主要的土源性线虫之一，寄生人体的钩虫主要由十二指肠沟口线虫(AncylostomaDuodenaleDubini,1843)，简称十二指肠钩虫和美洲板口线虫(NecatorAmericanusStiles，1902)，简称美洲钩虫。钩虫呈全球性分布，据估计有4亿7 200万人感染，造成400万残疾调整生命年(DALYs)[1]。 虽然我国钩虫感染率显著下降，从1988-1992年全国人体寄生虫分布调查时的17.17%，到2014-2016年全国人体重点寄生虫病现状调查时的2.62%，但在人群土源性线虫感染中，钩虫感染率明显高于蛔虫和鞭虫[2]。因此，钩虫病是严重危害人们健康的重要公共卫生问题。

对钩虫病的检测目前极大依赖镜检法，该方法敏感度和特异度低，并依赖于检测人员的镜检能力。而十二指肠钩虫和美洲钩虫虫卵无法通过镜检法鉴别，需进一步孵化出钩蚴以鉴别确诊。然而，随着防治工作的进展，钩虫病的感染率和感染度逐渐降低[2-3]，此法已难以应用于大规模监测和流行病学调查。而免疫学法检测的敏感性和特异性均存在局限，建立更敏感特异、简便快速的钩虫病检测方法是防治工作亟待解决的问题。核糖体转录间区序列(ITS)在种内具有高度保守性，而在种间显示不同程度的差异，因此已应用于钩虫的分子检测[4-6]。环介导等温扩增技术(LAMP)是近年发展起来的高效、简便的DNA扩增技术[7]，近年来逐渐应用于粪便中病原体DNA的检测[8-9]。本研究以美洲钩虫ITS序列为目标序列，通过软件设计特异引物应用于LAMP扩增美洲钩虫ITS序列，并优化扩增条件，对建立的LAMP方法评价其检测的灵敏度和特异性，并应用现场样本评价其检测的敏感性和特异性，从而建立起以虫卵为检测材料的检测美洲钩虫病的LAMP法，为美洲钩虫病提供特异、敏感、快速简便的检测方法，从而有助于我国钩虫病的防治。

1 材料与方法

1.1样本来源 美洲钩虫虫卵由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所药物室提供。日本血吸虫成虫、鞭虫成虫、猪蛔虫成虫、蛲虫成虫由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所健教中心提供。人粪便样本来自2017年四川省隆昌县、安徽省桐城市现场监测点，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所土食源室和安徽省桐城市血防所提供。新鲜的粪样，经改良加藤法镜检后，4 ℃保存，用于核酸提取。

1.2主要试剂 环介导等温扩增试剂盒购于北京蓝谱生物科技有限公司，常用DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒均购于德国Qiagen公司，Taq聚合酶、DNA标记物均购于日本TaKaRa公司，琼脂糖购自美国Promega公司，PCR仪(C1000TM Thermal Cycler)、电泳仪(PowerPac Basic)和凝胶成像系统(Molecular Imager Gel Doc XR System)均为美国BioRad公司产品。

1.3DNA提取 寄生虫样本按照试剂盒的操作步骤操作。提取粪便DNA样本时，在粪便样品中加入少量0.1mm玻璃珠，经高速震荡混悬后，按照QlAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒的操作步骤操作。提取的DNA，-20 ℃冻存备用。

1.4引物设计与合成 根据NCBI数据库中美洲钩虫ITS基因(登录号 LC036565.1)序列设计LAMP扩增引物，其中包括1对外引物(F3和B3)和1对内引物(FIP和BIP)。F3：5′-TTCAATCGCAATGGCTTG-3′ B3：5′-CTCACATTGGGCTAAAAAGG-3′ FIP：5′-TCGACGATGATCCATCTGCAAACCGGGTAAAAGTCGTAAC-3′ BIP：5′-CATGATCTAGAGAAACCAACACGCGTGGTG-ATACTCCCAACTT-3′。并参照文献[5]合成PCR引物，RTHW1F：5′-GATGAGCATTGCWTGAATGCCG-3′ RTHW1R：5′-GCAAGTRCCGTTCGACAAACAG-3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.5LAMP的敏感度和特异度评价 美洲钩虫DNA(浓度1 200 pg/mL)，按10倍稀释为120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板进行LAMP检测。以日本血吸虫、鞭虫、猪蛔虫、蛲虫等DNA为模板，进行LAMP检测方法，观察是否存在交叉反应。

1.6LAMP检测 反应体系为25 μL，取粪样DNA 2.0 μL，依次加入12.5 μL 2×反应缓冲液、1.0 μL引物混合物(1.6 μmol/L的FIP和BIP、0.2 μmol/L的F3和B3)，1.0 μL Bst DNA聚合酶(8U)以及1.0 μL钙黄绿素显色剂，加无核酸酶水至总体积25 μL，充分混匀后将反应管置于63 ℃水浴孵育70 min。反应结束后，肉眼观察各反应管的颜色，绿色为阳性，棕色为阴性。以美洲钩虫虫卵DNA为阳性对照、无核酸酶水为阴性对照。

1.7PCR检测及产物鉴定 25 μL PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP混合液(10 mmol/L)1 μL、正反向引物各1 μL(10 mmol/L)、Taq酶1 μL(5 U/μL)、DNA模板1 μL，加ddH2O至总体积25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果。PCR扩增产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果登陆GenBank进行序列比对。

1.8统计学分析 计算LAMP相对镜检法和PCR法检测美洲钩虫的敏感性和特异性。敏感性和特异性的计算公式如下：敏感性(%)=[真阳性数/(真阳性数+假阴性数)]×100%；特异性=[真阴性数/(真阴性数+假阳性数)]×100%。LAMP和PCR检测结果，采用SPSS 18.0统计软件对敏感性和特异性进行卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1LAMP检测美洲钩虫灵敏度和特异度 已建立的LAMP法，与日本血吸虫、鞭虫、猪蛔虫、蛲虫、肺吸虫均未见交叉反应。以美洲钩虫20条成虫DNA为模板，按10倍稀释为120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板进行LAMP检测，LAMP法可检测出稀释度为1.2 fg/mL的样本，即极限DNA浓度为1.2 fg/mL，见图1。

图1 以美洲钩虫成虫DNA为模板的LAMP法敏感性评价Fig.1 Sensitivity evaluation of LAMP method based on DNA of adult hookworm

2.2患者和健康人粪样检测结果 现场采集的粪便样本，分别用Kato-Katz法、PCR法和LAMP法检测美洲钩虫感染情况。将本研究建立的LAMP法分别与Kato-Katz法和PCR法检测结果比较发现，LAMP法相对Kato-Katz法的敏感性和特异性分别为95.24%和97.06%(见表1)，差异无统计学意义(χ2=0.5，P=0.479 5)。LAMP法相对PCR法的敏感性和特异性均为100%，无统计学差异(见表2，图2)。

表1 LAMP法和镜检法检测结果比较Tab.1 Comparison test between LAMP and Kato-Katz

表2 LAMP法和PCR法检测结果比较Tab.2 Comparison test between LAMP and PCR

A：M为DNA标记物、P为阳性对照、N为阴性对照。1、3、4、6、8和9为PCR阳性的粪便样本，2、5、7为PCR阴性的粪便样本。B：P为阳性对照、N为阴性对照。1、3、4、6、8和9为LAMP阳性的粪便样本，2、5、7为LAMP阴性的粪便样本。图2 PCR (A)和LAMP (B)检测粪便样本中美洲钩虫的结果Fig.2 Detection of N. Americanus of fecal samples by PCR (A) and LAMP (B), respectively

3 讨 论

传统的运用形态学方法镜检钩虫的手段，所需仪器设备相对简单，但一方面要求检测者具有较高的专业知识，需要通过长期的训练达到较熟练的技术，与检测者的经验存在较大关联。另一方面对待检样本也有较高要求，首先要保证样本的新鲜度，短时内需要金策。同时，对于轻度感染患者，驱虫后获取的虫体较少或虫体破损等均会影响检查者的判断[10]。因此，传统检测方法在低感染率流行区做大规模流行病学筛查费时费力。随着分子生物学技术发展，具有较高敏感度和特异度的检测方法被应用于钩虫检测中，如PCR技术[11]，弥补了形态学分类上的不足。进一步实时荧光定量PCR技术[12-13]，减少了原始PCR技术中对扩增产物通过凝胶电泳观察条带步骤。但以上PCR技术必须在一定的实验室条件下完成，对仪器设备有一定的要求。LAMP是一种新的核酸扩增方法，具有敏感、特异、简易、快速等特点，无需高端仪器设备，可直接用肉眼观察结果，已应用于病原检测中。

本研究建立的LAMP法以检测粪便中美洲钩虫虫卵为目的，可有效检测DNA浓度低至1.2 fg/mL的样本，在目前感染率较低的国情下，降低了漏检率，为筛查和治疗提供了有效的诊断手段。在LAMP法与Kato-Katz法对比实验中，出现Kato-Katz法阳性，而LAMP阴性的情况，原因可能是由于虫卵在粪便中分布不均，随机抽取粪样时存在漏检的情况。本研究中，Kato-Katz法一粪三检，而LAMP法仅随机抽取一份样本，因此漏检率显著增高。然而在检测样本量降低2/3的情况下，LAMP法相对Kato-Katz法能达到极高的敏感性和特异性，说明了本研究中LAMP法具有较大的现场推广价值。

为提高LAMP法的敏感度和特异度，可从以下2个方面避免假阴性和假阳性情况。第一，提高钩虫虫卵DNA提取效率。我们在实验中发现，由于美洲钩虫虫卵卵壳具有一定的保护能力，因此DNA提取时需要采取措施破壁以释放DNA。本实验在粪样中加入0.1 mm玻璃珠，经高速震荡后，按照试剂盒的手册进行操作，可有效提取钩虫虫卵DNA，提高检出率。第二，减少污染以降低假阳性率的发生。基于LAMP法的高灵敏度，该法容易出现假阳性情况。正确的实验操作手法，避免实验试剂的污染。同时LAMP扩增反应结束后，避免打开反应管，有效避免气溶胶污染实验环境。

利益冲突：无