NLRP3炎症小体在甲型流感病毒和MRSA致小鼠肺炎早期的作用差异

石云锋,师小函,巴俊慧,陈健宁,罗进梅,吴本权

甲型流感病毒(甲流病毒)引起急性呼吸道感染，可导致大范围传播流行。H1N1、H5N1、H7N9等亚型具有从哺乳动物或禽类传染至人类的能力，给人类健康及全球公共卫生带来极大的威胁和挑战[1-2]。甲流病毒感染易合并或继发耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染，引起重症肺炎，病死率高达60%[3]。在肺炎早期，肺泡巨噬细胞介导的非特异性免疫占抗感染免疫的主要作用。NLRP3炎症小体是肺泡巨噬细胞发挥抗感染免疫作用的重要模式识别受体，诱导白介素(interleukin，IL)-1β的释放，介导下游的炎症反应。大量研究表明，NLRP3炎症小体在抗甲流病毒免疫中发挥保护作用[4]。也有研究发现，MRSA经吞噬溶酶体途径亦可激活NLRP3炎症小体[5]。但NLRP3炎症小体在甲流病毒与MRSA肺炎早期的具体作用及强度如何，目前国内外未见对比研究。本文以甲流病毒鼠肺适应株H1N1/FM1与 MRSA临床分离株分别感染小鼠建立肺炎模型，对比分析NLRP3炎症小体在肺炎早期的活性及相应的炎症反应，探讨NLRP3炎症小体在甲流病毒肺炎与MRSA肺炎早期的作用差异。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1甲型流感病毒H1N1/FM1株、MRSA菌株及实验小鼠 甲型流感病毒H1N1/FM1(甲流病毒H1N1)为鼠肺适应株，获赠于暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室。MRSA菌株为中山大学附属第三医院呼吸与危重症医学科实验室分离鉴定的临床菌株。雄性健康C57BL/6小鼠15只，鼠龄30～35 d，购于广东省实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0002，SPF条件下饲养，随机分成空白对照组、甲流病毒H1N1组、MRSA组3组，每组5 只。本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》相关原则。

1.1.2主要试剂 MLV第一链合成试剂盒、SYBR○Rselect master mix购于美国Life Technologies公司；NLRP3单克隆兔抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；NLRP3免疫荧光羊抗兔二抗购于美国R&D公司；内参抗体GAPDH兔抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、凯基全蛋白提取试剂盒及凯基BCA法蛋白浓度检测试剂盒购于广州杰特伟科技有限公司；ELISA检测试剂盒购于美国R&D公司。

1.2 方 法

1.2.1甲流病毒H1N1复苏、毒力测定 复苏液氮罐中冻存的甲流病毒H1N1/FM1株，于9 d龄鸡胚尿囊腔连续传代2次扩增，以鸡红细胞血凝试验测定扩增的病毒效价。用无血清DMEM培养液对H1N1/FM1病毒株行连续10倍递次稀释至10-8。参考实验基础确定半数致死量(LD50)浓度[6-7]。

1.2.2细菌培养 在室温下解冻-80 ℃冻存的MRSA菌株，接种于血琼脂培养基，于37 ℃温箱过夜培养，用接种环挑取菌落溶于无菌PBS中，测定其在600 nm处吸光度(optical density，OD600)。OD600=0.6时细菌含量约1×109/mL。预实验确定半数致死量为OD600=0.6之菌液50 μL。

1.2.3甲流病毒H1N1及MRSA滴鼻建立小鼠肺炎模型 腹腔注射10%水合氯醛80 μL麻醉小鼠。空白对照组每只小鼠以50 μL PBS液滴鼻，甲流病毒H1N1组每只小鼠以50 μL LD50浓度的甲流病毒H1N1滴鼻，MRSA组每只小鼠以50 μL测定OD600为0.6的MRSA菌液滴鼻，感染24 h，观察记录小鼠的一般生存状况、死亡率、体重等。体重变化率(%)=(24 h体重-初始体重)/初始体重×100%。

1.2.4标本取材 感染24 h后，眼眶取血后处死小鼠，血清留作IL-1β细胞因子检测，摘取小鼠肺脏，左肺上叶和下叶分别留作提取蛋白和RNA，右肺留作病理切片和HE染色。

1.2.5RT-qPCR法检测NLRP3蛋白和IL-1β的mRNA表达水平 将各组小鼠肺组织称重，研磨制成悬液，用Trizol法提取组织总RNA，检测RNA的浓度。采用ABI7500系统进行PCR反应，反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min预变性，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 1 min退火，共进行40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s延伸。记录目的基因与内参基因的Ct值，用mRNA=2-ΔΔCT计算 mRNA相对表达量。PCR反应引物见表1。

1.2.6Western Blot法检测NLRP3蛋白的表达水平 分别裂解每只小鼠肺组织后，提取总蛋白。按凯基BCA蛋白含量检测试剂盒说明书，测定蛋白浓度。按Western Blot步骤，转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，在Chemi Scope化学发光成像系统显影，用Image J软件分析目的蛋白灰度值，计算其蛋白相对表达量。

1.2.7ELISA检测血清中IL-1β的浓度 根据ELISA检测试剂盒的操作流程，空白孔及每个标准品设3个复孔，制作标准曲线，检测小鼠血清IL-1β的浓度。

2 结 果

2.1小鼠生存状况 各组小鼠均全部存活。空白对照组进食、活动如常，24 h后平均体重增加4.32%；甲流病毒H1N1组及MRSA组均出现竖毛、摄食量下降、活动减少的情况，24 h后两组平均体重分别减轻5.88%与6.07%。

2.2小鼠肺组织病理切片结果 空白对照组小鼠肺组织病理切片未见病理损伤，支气管壁完整，肺泡内无炎症细胞浸润。甲流病毒H1N1组小鼠肺组织见局灶性支气管炎和弥散性间质肺炎，较多的炎症细胞浸润，血管扩张充血，肺泡结构破坏。MRSA组小鼠肺组织病理可见炎症反应如甲流病毒H1N1组，但充血情况明显加重，表现出更严重的炎症反应(图1)。

A：control group； B： H1N1 group； C：MRSA group； A1、B1、C1 HE ×100；A2、B2、C2 HE×400图1 甲流病毒H1N1和MRSA感染24 h致小鼠肺炎组织病理改变 HE染色Fig.1 Pathology of pneumoniae caused by influenza H1N1 and MRSA infection for 24 h in mouse.

2.3甲流病毒H1N1组与MRSA组NLRP3蛋白的mRNA及蛋白相对表达量 甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺组织NLRP3蛋白的mRNA表达明显升高，与空白对照组、MRSA组比较差异均有统计学意义(F=38.782，P均<0.05，图2A)。MRSA组NLRP3蛋白的mRNA表达水平也升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(F=38.372，P=0.03，图2A)。Western blot检测发现甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺组织NLRP3蛋白的表达明显升高，与空白对照组、MRSA感染组比较差异均有统计学意义(F=1 325.64，P均<0.01，图2B和2C)，与mRNA表达水平的结果相一致。MRSA组NLRP3蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(F=1 325.64，P=0.08，图2B和2C)。

A:representative of the NLRP3 mRNA level in mice subjected to different treatments；B:representative of the NLRP3 protein level in mice subjected to different treatments；C:representative of the quantification of the protein level of NLRP3 subjected to different treatments；1) P<0.05；2) P<0.01图2 甲流病毒H1N1和MRSA感染小鼠24 h肺组织NLRP3蛋白的mRNA及蛋白表达水平Fig.2 mRNA and protein level of NLRP3 in influenza H1N1 and MRSA infected mouse for 24 h

2.4甲流病毒H1N1组与MRSA组IL-1β的mRNA相对表达及血清浓度 甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺组织IL-1β的mRNA表达升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(F=1 253.97，P<0.01，图3A)。甲流病毒H1N1感染引起小鼠血清IL-1β浓度升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(F=41.97，P<0.01，图3B)。MRSA组IL-1β的mRNA表达水平明显升高，与空白对照组、甲流病毒H1N1组比较差异均有统计学意义(F=1 253.97，P均<0.01，图3A)。MRSA组血清IL-1β浓度明显升高，高于甲流病毒H1N1组与空白对照组，差异均有统计学意义(F=41.97，P均<0.01，图3B)。

A:mRNA level of IL-1β in in mice subjected to different treatments；B:serum concentrations of IL-1β in mice subjected to different treatments；2) P<0.01图3 甲流病毒H1N1和MRSA感染小鼠24 h肺组织IL-1β的mRNA相对表达量和小鼠血清中IL-1β的浓度Fig.3 mRNA level and serum concentrations of IL-1β in influenza H1N1 and MRSA infected mice for 24 h

3 讨 论

甲流病毒感染的靶细胞为呼吸道上皮细胞，其能直接感染肺泡巨噬细胞及树突状细胞等免疫细胞，引起炎症反应及肺损伤[8]。甲流病毒感染的预后取决于机体的免疫反应及有无继发感染。甲流病毒感染继发细菌性肺炎，是导致临床死亡的主要原因，而MRSA是继发感染最常见的细菌[9]。甲流病毒与MRSA在致病及免疫应答方面存在某些相关。

在甲流病毒及MRSA肺炎的早期，机体抗感染的主要机制是固有免疫反应。其中最重要的免疫细胞是肺泡巨噬细胞[10]，数量占肺泡灌洗液中细胞成分的80%。而位于其细胞质中的NOD样受体(NOD like receptor，NLRs)是其在感染早期介导固有免疫反应的机制之一[11]。

NLR途径在抗感染中的作用以NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体研究最为深入。NLRP3炎症小体的活性形式是由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)与半胱天冬酶1(caspase-1)形成的三聚体。其中NLRP3蛋白是NLRP3炎症小体活性的核心。NLRP3炎症小体的激活及信号传递存在双信号通道。信号通路1为模式识别受体如Toll样受体(TLRs)识别各种病原微生物及其组成成分，通过NF-κB途径，诱导IL-1β基因的表达，分泌无活性的pro-IL-1β。信号通路2为NLRP3炎症小体三聚体形成，自剪切无活性的caspase-1为活化的cleaved-caspase-1，cleaved-caspase-1剪切pro-IL-1β为IL-1β。IL-1β进一步诱导炎症细胞因子、氧化因子和趋化因子的释放，触发炎症反应清除病原体并自我调节炎症反应强度[12]。因此，绝大多数研究选用NLRP3蛋白及IL-1β监测NLRP3炎症小体活性及炎症反应强度。

大量研究认为，甲流病毒激活NLRP3炎症小体并介导炎症反应，在甲流病毒感染中的被激活对机体起保护作用[13]。本实验发现，与空白对照组比，甲流病毒H1N1组NLRP3蛋白的mRNA表达及蛋白表达均增强，IL-1β的mRNA表达及血清浓度也升高，肺组织病理发现炎症反应，表现出NLRP3炎症小体信号链的活化。可以推论NLRP3炎症小体在甲流病毒性肺炎的早期活化并起促进炎症反应作用，感染早期适度的炎症反应有助于清除病原体，与主流的研究相一致。

本实验发现，MRSA组比空白对照组NLRP3蛋白的mRNA表达稍增高，Western blot检测NLRP3蛋白表达与空白组比较差异没有统计学意义，但NLRP3蛋白的mRNA及Western blot均低于甲流病毒H1N1组。然而，MRSA组IL-1β的mRNA表达明显增加，血清IL-1β浓度也明显升高，明显高于空白对照组，也高于甲流病毒H1N1组，表明MRSA肺炎早期炎症反应比甲流病毒H1N1肺炎更为严重，肺组织病理进一步证实了该发现。该发现也解释了甲流病毒与MRSA在感染早期致病力不同的现象。

MRSA组IL-1βmRNA水平及蛋白表达水平的增强与NLRP3蛋白的活化程度不相一致，表明NLRP3炎症小体不在MRSA肺炎早期IL-1β的产生及炎症反应中起主要作用。分析可能的机制如下：①虽然也有研究发现MRSA可通过吞噬-溶酶体途径产生的活性氧激活NLRP3炎症小体[5]，但这个过程是间接的，NLRP3炎症小体的激活依赖MRSA结构成分肽聚糖在吞噬体内的降解过程。MRSA通过其它途径可更直接更快速地刺激炎症细胞释放炎症细胞因子，如本课题组早期研究发现MRSA可通过TLR2-NF-κB途径引起巨噬细胞坏死及大量TNF-α、IL-10释放[14]。②甲流病毒H1N1激活NLRP3炎症小体引起炎症细胞焦亡，反馈调节炎症反应强度。有研究显示，多种甲流病毒株与肺泡巨噬细胞共培养激活NLRP3炎症小体，在8～24 h肺泡巨噬细胞产生IL-10增加，反馈抑制了强烈的炎症反应[12]。③其它的炎症细胞如中性粒细胞参与了抗甲流病毒及抗MRSA的早期免疫反应。研究发现，甲流病毒感染引起肺炎时，中性粒细胞为NLRP3炎症小体提供过氧化物等活化的第二信号促进肺泡巨噬细胞释放IL-1β[15]。还有研究发现，在MRSA感染中，中性粒细胞不经NLRP3炎症小体途径而由RIPK3通路促进肺泡巨噬细胞释放IL-1β[16]。结合上述讨论及本研究结果提示，在MRSA肺炎的防治中，应积极寻找别的靶点或信号途径，如其它的炎症小体甚至别的模式识别受体，尤其是甲流病毒感染继发MRSA肺炎时，不能单一关注NLRP3炎症小体通路。

综上，本研究验证了NLRP3炎症小体在甲流病毒性肺炎早期的活性及作用，并推测NLRP3炎症小体并不在MRSA肺炎早期更剧烈的炎症反应中起主要作用，后者的炎症反应有其它的信号通路或炎症细胞参与介导。但是，需要多个时间点的实验设计才能系统地验证NLRP3炎症小体在MRSA感染中的作用。同时，NLRP3炎症小体还包含ASC、caspase-1等结构成份，NLRP3炎症小体在甲流病毒与MRSA单独感染甚至混合感染时的具体作用、机制以及信号网络有待后续进一步深入研究。

利益冲突：无