Ⅵ型分泌系统研究进展

魏丹丹，谢中艺，杨帆帆，尹芬芬，黄新祥，张 盈

VI型分泌系统(Type VI secretion system，T6SS)存在于约25%的革兰阴性细菌中，是2006年Pukatzki等[1]首次在霍乱弧菌(V.cholerae)中发现的一个细菌膜表面结构类似于T4噬菌体，以一步法将效应因子分泌至胞外的分泌系统[2]。T6SS可将毒性效应物注入真核细胞或原核细胞，进而可被细菌用于破坏真核宿主细胞或对抗其他细菌，而表达T6SS的细菌自身可合成免疫蛋白，以防止自我中毒或成为周围同类细菌群体的攻击目标[3]。T6SS自发现以来被认为是革兰氏阴性菌重要的毒力决定因子[4]。本文主要围绕T6SS分泌装置的结构、表达及其功能来进行简要综述。

1 T6SS的结构

在单个细菌基因组中常发现多个T6SS基因簇，例如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)有2个T6SS基因簇[5]、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)有6个T6SS基因簇[6]，它们的功能通常不具有冗余性。

T6SS是由13种VI型分泌系统核心结构蛋白(Tss)组成的收缩装置[7]。这个收缩装置由3个主要复合物构成：跨膜复合物、底板复合物和尾刺。以肠集聚性大肠埃希菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)为例(图1)。

1.1跨膜复合物 该复合物通常由3种蛋白质TssM，TssL和TssJ组成，构成1个环状的通道结构跨越细胞膜[8]。TagL直接与TssL作用，通过单一的C-末端TMS(跨膜片段)将装置锚定在膜上[9]。

1.2底板复合物 由TssE，TssF，TssG和TssK形成的底板复合物可连接跨膜复合物和尾部。组成底板复合物的这4种蛋白质的比例是1∶2∶1∶6。TssG肽是核心，2个TssF与TssG一起形成三角形状，而TssG的2个扩展区域分别与2个TssK三聚体连接[10]。

1.3尾刺 尾刺主要由溶血素共调节蛋白(Hcp)六聚体形成的内管及其顶部的尖峰复合物组成。尖峰复合物由缬氨酸-甘氨酸重复蛋白G(VgrG)的三聚体组成，并且在大多数情况下与脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重复蛋白(PAAR)共同组成[10]，Hcp和VgrG同时也是分泌至胞外的转位蛋白[11]。由TssB-TssC(VipA/VipB)组成的收缩鞘围绕着尾刺[12]。尾部的组装需要TssA，其与基板复合物，内管和鞘组件相互作用并稳定尾管的远端[13]。ClpB家族的AAA+ ATPase ClpV(TssH)可将尾管鞘解聚成单体成分再循环利用，并为尾管鞘的收缩提供能量[14]。在合适的条件下，T6SS可进行组装并发挥功能。

除了上述核心结构蛋白外，T6SS基因簇还编码辅助蛋白，其包含组装分泌装置所需的组分，控制T6SS的表达或活性作用的调节蛋白等[15]。编码效应蛋白的基因下游总是编码1个同源的免疫蛋白，被称为效应蛋白/免疫对。如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)T6SS免疫蛋白(Tse-specific immunity protein)Tsi1、Tsi3可以分别抑制T6SS效应蛋白(Type six exported)Tse1、Tse3水解细菌细胞壁的肽聚糖[16]，而免疫蛋白Tsi2直接与胞质效应蛋白Tse2结合形成毒素-免疫蛋白模块，而使效应蛋白失活[17]。

IM为内膜；OM为外膜；Tss为Type six secretion；PAAR为Proline-Alanine-Alanine-Arginine；VgrG为Valine-glycine repeat proteins G；Hcp为Hemolysin-coregulated protein；TagA为3-methyl-adenine DNA glycosylase A图1 VI型分泌系统结构示意图[56]Fig.1 Schematic representation of the T6SS[56]

2 T6SS的表达

T6SS的表达及活性受到各种机制的严格调节，其机制可归类为环境因素及自身调控因素。在不同细菌及不同T6SS亚型中T6SS被诱导表达所需的条件往往各不相同，这可能与其发挥功能的环境相关。

2.1环境因素对T6SS表达的影响V.parahaemolyticus的T6SS1分泌蛋白Hcp1在模拟海洋环境条件(2% NaCl，23～30 ℃)下表达水平较高，而T6SS2分泌蛋白Hcp2却在模拟宿主体内环境条件(0.5% NaCl，37 ℃)下表达水平高，这可能与V.parahaemolyticus在海水中时T6SS1起作用，而在海洋动物体内时T6SS2起作用有关[18]。

B.Pseudomallei的6个T6SS基因簇中只有T6SS2基因可在M9低盐0.4%葡萄糖琼脂造成的营养缺乏环境中表达。有趣的是亚抑菌浓度的喹诺酮类抗生素能够促进此菌T6SS2、T6SS3、T6SS4、T6SS6的Hcp蛋白的表达，这提示了抗感染治疗过程中抗生素足量使用的重要性[6]。

通过采用分裂GFP技术，Clemens DL等人确定了3种刺激物可以诱导新凶手弗朗西丝菌(Francisellanovicida)中T6SS IglA/IglB(VipA/VipB同系物)鞘的组装，分别是1)巨噬细胞内环境，2)在5% KCl环境下指数晚期的高密度细菌条件，3)放置在盖玻片下。KCl是巨噬细胞内的一种刺激物，在体外培养基中可能需要更高浓度的KCl以补偿细胞内其他刺激物的缺失，而盖玻片下的诱导机制目前尚不清楚，可能涉及物理刺激，氧气张力改变或其他环境影响[19]。

Yang X等人发现假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)中GDP/GTP焦磷酸激酶RelA是主要的ppGpp合成酶，细胞内氨基酸缺乏时，RelA响应于核糖体A位点中未携带氨基酸的tRNA而合成(p)ppGpp(鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸)，通过调节因子RovM和RovA上调T6SS4的表达，以对抗营养饥饿引起的压力[20]。

2.2细菌自身对T6SS表达的调控 细菌自身的调控对T6SS的表达及活性可总结为转录调控、转录后调控以及翻译后调控。1)转录调控。肠集聚性大肠埃希菌EAEC在铁富足的条件下，铁摄取调控因子(ferric uptake regulator, Fur)可与sci1 T6SS基因簇启动子附近的Fur盒序列结合，从而抑制T6SS相关基因的转录[21]。细菌增强子结合蛋白(bacterial enhancer binding proteins, bEBP)(即σ54激活蛋白)由T6SS毒力相关的分泌基因簇(Vas)编码，可在T6SS启动子区域与σ54结合序列结合从而激活转录[22]。 2)转录后调控。P.aeruginosaT6SS含3个溶血素共调节蛋白分泌岛(Hemolysin-coregulated protein secretion island，HSI)，分别为HSI-Ⅰ、HSI-Ⅱ和HSI-Ⅲ，其中HSI-I直接受二甲基转移酶RsmA的负调控。双组份调控系统GacS/GacA通过调节下游小RNA(rsmY和rsmZ)的表达来调控靶基因的表达。rsmZ为RsmA的拮抗剂，而传感器激酶RetS是RsmA调控途径的一部分。RetS是一种多功能调节剂，RetS突变可导致T6SS的上调[23]。3)翻译后调控。如P.aeruginosaH1-T6SS翻译后受到丝苏氨酸蛋白激酶PpkA的正向调控，而受到同源磷酸酶PppA的负向调控，这种控制是通过含有插头结构域(Forkhead-associated domain，FHA)的Fha1蛋白结构中苏氨酸残基的磷酸化来实现的[24]。

3 T6SS的功能

3.1T6SS对细菌生物膜形成的影响 生物膜是细菌分泌脂质蛋白、纤维蛋白、多糖基质等形成大量聚集的细菌膜样物，常粘附于固体表面。研究发现，T6SS突变菌形成生物膜能力显著降低[25]。1)先前在E.coli和V.parahaemolyticus中的研究表明，T6SS本身编码的蛋白具有促进生物膜形成的能力，如外膜脂蛋白SciN[26]。2)在生物膜生长期间T6SS相关蛋白被激活表达，与表征的生物膜因子如膜外多糖共同调节生物膜的形成[27]。3)T6SS也可通过影响生物膜相关基因发挥调节作用。研究发现，弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS缺陷株的全菌蛋白中FliC的表达明显下调；在其培养上清中FliC、FlgK和FliD的表达下调均十分明显[28]。EAEC中sci1 T6SS激活可促进粘附，生物膜形成与黏附相关基因有密切关系。

3.2T6SS对细菌抗菌作用的影响 近年来不断有报道，革兰阴性菌利用T6SS分泌的抗菌因子参与细菌间的生存竞争。T6SS可将效应因子注射入邻近的靶细胞以对抗其竞争者。对于T6SS装置的作用方式近些年通过活细胞荧光显微技术在V.cholerae、沙雷氏菌和E.coli中直接观察到了TssB鞘运动，分为3个步骤：1)鞘聚合成完全伸展状态，2)快速收缩，3)ClpV的分解[29-31]。目前己知的与细菌竞争相关的T6SS效应因子可归为4类，分别为1)裂解细胞壁类效应因子，如水解肽聚糖的酰胺酶Tse1、多糖酵解酶Tse3[32]；2)损伤细胞膜类效应因子，如直接水解细胞膜脂质成分的磷脂酶效应因子Tle家族[33]，刺入细胞膜导致渗透压失衡的穿孔蛋白Colicin[34]；3)降解核酸效应因子，如Rhs(Rearrangement hotspot)蛋白，编码效应因子C端核酸内切酶区域，可降解靶细胞DNA[35]；4)生长抑制因子如NAD(P)+糖基水解酶等[36]。其中针对于细胞膜的效应因子也意味着对真核细胞膜起作用。

细菌在感染过程中往往需要比原土著菌群有更强的竞争优势以竞争营养和生存空间。Fu Y等[37]观察到T6SS赋予V.cholerae特别的定植竞争优势，并且该优势不依赖于抗真核效应物VgrG1，表明T6SS可能通过其它效应物作用于常驻的共生细菌物种。近期研究表明小鼠模型中V.cholerae的T6SS确实能够杀死共生菌，并且这种抗菌活性有利于V.cholerae在小鼠体内的定植[38]。还有研究表明鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)在肠道中的成功定植需要沙门氏菌致病岛-6(SPI-6)编码的T6SS。在体外环境中，胆汁盐可增加S.TyphimuriumSPI-6的抗菌活性，使其以T6SS依赖的方式杀死共生细菌。Hcp1是在体外杀死产氧克雷伯菌的必要条件，且该活性是由Hcp1与抗菌酰胺酶Tae4的特异性相互作用介导的[39]。Hsieh PF等[40]的体外实验也证实了肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)胞内增殖蛋白F1-2(Intracellular multiplication protein F，IcmF1-2)和Hcp在细菌种内和种间杀伤作用中是必需的。

3.3T6SS影响细菌对真核细胞的致病力 细菌感染宿主的过程中需要克服宿主的免疫防御机制，T6SS在此过程中发挥着重要的作用。迄今为止发现的T6SS抗真核效应因子可分为两类：第一类为VgrG蛋白的亚类。如V.choleraeVgrG1中的C末端肌动蛋白交联结构域[41]和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)VgrG1中的ADP-核糖基转移酶结构域对真核宿主细胞具有细胞毒性作用[42]。第二类是独立靶向宿主细胞的毒素。V.choleraVasX的N-末端PH同源结构域(Pleckstrin homology domain)可能涉及结合宿主膜脂质，从而干扰宿主磷酸肌醇代谢和信号传导[43]。另外效应蛋白Tle5A和Tle5B结合丝苏氨酸激酶Akt也可促进P.aeruginosa内化作用[44]。

3.3.1对上皮细胞的作用 多数细菌虽然被认为是细胞外病原体，但能够侵入非吞噬细胞，如粘膜上皮细胞和血管内皮细胞。免疫逃逸的机制之一是细菌逃避到无吞噬作用的宿主细胞中，以躲避宿主的免疫系统，成功感染并在宿主体内持续存在，通过紧密的上皮细胞屏障侵入更深的组织[45]。

首先细菌黏附于内皮细胞，近期关于K.pneumoniae的研究表明在icmF1和icmF2缺陷时显示出1型菌毛的表达降低，对结肠直肠上皮细胞的粘附和侵袭降低，并且在体内竞争力减弱[40]。其次细菌侵袭进入内皮细胞，最常见的内化作用为改变肌动蛋白重塑机制以操纵细胞骨架生成富含肌动蛋白的细胞表面突起，促进粘附细菌的内化。此外微管也参与了细菌的内化。据报道秋水仙碱或诺考达唑抑制微管形成后，H2-T6SS分泌的VgrG2b蛋白促进P.aeruginosa内化进入上皮细胞的作用被抑制[46]。研究表明将E.coliK1的Hcp1蛋白纯化后干预人脑微血管内皮细胞，发现Hcp1蛋白不需要易位到细胞内部也可诱导肌动蛋白细胞骨架重排和细胞凋亡[47]。

3.3.2对巨噬细胞的作用 细菌T6SS与宿主巨噬细胞之间的作用，可归为4类：1)操控宿主细胞骨架重排抑制吞噬。多种细菌中证实T6SS可通过改变巨噬细胞骨架结构从而抵抗吞噬作用。新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)T6SS效应物TecA使Rho GTP酶脱去酰胺基，破坏巨噬细胞肌动蛋白细胞骨架并激活Pyrin炎症小体引发炎症反应[48]。2)抵抗巨噬细胞内活性氧(ROS)的杀伤进行免疫逃逸。据Wan B等人的报道肠出血型大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)以T6SS依赖的方式分泌效应物KatN(含锰的过氧化氢酶)。RNA聚合酶σ因子RpoS和调控因子OxyR可以促进katN的表达，而H-NS可抑制其表达。EHEC被巨噬细胞吞噬后，KatN可分泌到宿主细胞胞浆中，导致细胞内活性氧(ROS)水平降低，促进EHEC在巨噬细胞内存活[49]。此外，Y.pseudotuberculosisT6SS4分泌的Zn+结合蛋白底物YezP以结合锌离子等方式逃避巨噬细胞的杀伤[50]。3)引起宿主细胞死亡。P.aeruginosaH2-T6SS的分泌蛋白磷脂酶TplE具有一个类似于真核PGAP1蛋白的结构域，可定位于内质网并通过激活未折叠蛋白质反应(UPR)，从而促进自噬[51]。在鼠巨噬细胞中，迟钝爱德华菌(E.tarda)上调Ⅲ型分泌系统(T3SS)/T6SS基因从而增强细菌毒力，使其可在巨噬细胞内复制并诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)依赖的细胞凋亡[52]。4)引发炎症应答。Chen H等[53]发现E.tardaT6SS效应物EvpP可抑制细胞质Ca2+的增加，在MAPK-JNK的上游调节NLRP3炎性体，进一步影响对caspase-1的激活。A.hydrophila中也证实Hcp能够与巨噬细胞结合并诱导IL-10和转化生长因子TGF-β的产生，从而影响巨噬细胞的活化，并招募其他细胞免疫成分[54]。

4 展 望

近年来，对于T6SS基因、结构、调控、功能等各个方面的研究越来越深入。由于电子显微镜的应用，不仅可确认T6SS各结构组成，对于其运动方式也可进行更加直观的观察[10,55]。然而T6SS在不同的细菌中的功能表型有着很大的差异。细菌内部对于T6SS功能的调控，以及T6SS到底涉及细菌哪些生理功能还需要进一步的探究。最重要的是虽然在多种细菌中均有报道T6SS在细菌对宿主的致病力中起着重要的作用[49]，然而细菌T6SS是通过怎样的机制对宿主的免疫系统产生影响，宿主又是通过怎样的免疫机制应对的，这些问题依然值得关注，致病机理和防控措施问题的探讨对于感染性疾病的防治具有重要的意义。

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