4 ℃无氧保存时间对绵羊粪便中线虫卵孵化率的影响

吕 旭，苏 倩，刘晓磊，陆 静，方 伟，王文龙

（内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，

内蒙古呼和浩特 010018）

家畜养殖过程中长期不科学地滥用抗寄生虫药，使得全世界范围的寄生虫相继出现抗药性[1-2]，部分地区已经严重到了无药可用的地步，这些问题给畜牧业造成了重大经济损失，已成为世界性问题。对寄生虫进行耐药性体外检测是控制寄生虫耐药性产生的重要手段之一。而虫卵孵化试验[3]（egg hatch assays，EHAs）、幼虫麻痹移行活力测试[4]、幼虫发育试验[5]、静止期幼虫形态分析[6]、幼虫采食抑制试验[7]、寄生虫基因组学研究[8]和分子生物学研究[9]等都需要孵化幼虫，因此粪便中的虫卵孵化率是决定这些试验或研究成败的重要因素。这些体外试验或研究大都需要新鲜粪便样品，这给样品采集带来不便，因而新鲜粪便样品的保存、留样显得尤为重要。目前，粪便样品的长时间保存是否会影响到后续的试验或研究进程鲜有报道。基于这个因素，现将4 ℃无氧环境下，粪便保存时间对虫卵孵化率的影响作一系统分析，旨在选择一个较为理想的粪便保存时间，为绵羊消化道线虫的耐药性试验或研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

内蒙古乌兰察布市察哈尔右翼后旗某羊舍虫卵数（EPG）≥10 000 的绵羊新鲜粪便，以及饱和食盐水、生理盐水、1640 培养液、PBS 缓冲液（含有250 mg/L的两性霉素B和10 mL/L的青链霉素）、24 孔培养板、倒置显微镜、温箱、离心机、真空封口机等。

1.2 粪便保存

将采集的新鲜绵羊颗粒状粪便装入真空袋（70 mm×100 mm），10 g/组，用真空封口机将真空袋密封，放入4 ℃冰箱。野外环境下，及时将采集的新鲜粪便放入含有冰袋的保温箱中，并尽快放入4 ℃冰箱。

1.3 虫卵收集

参考世界兽医寄生虫学促进协会（WAAVP）推荐的虫卵孵化试验EHAs 方法[10-11]，并对虫卵提取系统进行调整，收集线虫卵，制备虫卵混悬液。取10 g 4 ℃无氧环境保存的绵羊粪便，加入50 mL 自来水充分搅拌备用；将500、145、20 μm 3 种铜筛，从上至下依次叠放，把搅拌好的粪汁倒入500 μm 铜筛并平铺开，等待5 min；用生理盐水冲洗20 μm 铜筛中的沉积物，将沉积物用吸管吸入50 mL 离心管，3 000 r/min 离心5 min，弃掉上清液；加入饱和食盐水混合均匀，3 000 r/min 离心3 min，收集上清液；将上清液倾入20 μm 铜筛中，用生理盐水冲洗10～20 s，然后再次用吸管吸入50 mL 于离心管中，3 000 r/min 离心5 min；弃掉上清液，加入PBS 缓冲液稀释，得到每1 mL 含有（170±20）个虫卵的混悬液，备用。虫卵混悬液在每次虫卵孵化前现配现用。

1.4 虫卵孵化

采用24 孔培养板，孔内加入1 mL 含有（170±20）个虫卵的混悬液和1 mL 1640 培养液，每次试验设6 个重复，用封口膜密封，27 ℃孵育48 h；取出24 孔培养板，加入2 滴Lugol's 液终止孵化，在显微镜下计数每个孔中幼虫和虫卵的具体数量；取6 孔数据平均值，并计算虫卵孵化率。自粪便采集日起，分别在采集后0、3、6、9、12、15、18 和21 d 重复进行虫卵孵化试验，共进行8 次。

1.5 数据统计

利用Microsoft Excel 2010 对数据进行统计学分析，并取每次试验的平均值绘制折线统计图。虫卵孵化率=[平均幼虫数/（平均幼虫数+平均虫卵数）]×100%

2 结果与分析

结果显示，4 ℃无氧环境下，绵羊粪便在保存0、3、6、9、12、15、18 和21 d 的虫卵孵化率 分 别 为90.07%、78.85%、67.02%、50.51%、22.18%、9.21%、9.94%和9.68%（表1）。

表1 4 ℃无氧环境保存不同时间的虫卵孵化情况统计

数据分析显示，粪便中的线虫卵在采集当天孵化率达到90%以上，但随着保存时间的延长，虫卵孵化率逐渐降低，其中保存9 d 内的虫卵孵化率下降较平缓，9 d 时仍有50.51%的虫卵能够得到良好的孵化，但9 d 后的虫卵孵化率急剧下降至22.18%，15 d 后孵化的幼虫数极少，孵化率无明显变化。

3 讨论

新鲜绵羊粪便的低温无氧保存限制了粪便中线虫卵发育所需的适宜条件，使虫卵启动自身保护机制而停止发育，从而有效抑制了粪便保存过程中虫卵发育成幼虫。由于EHAs 等寄生虫耐药性体外检测方法均需要未发育的虫卵[10]，只能使用新鲜粪便或一定时限的低温无氧保存粪便。但低温无氧保存时限过长，也会影响这些方法的准确性和适用范围，若时限过长，粪便中的虫卵会发育，就可能导致假阳性结果。之前有研究人员报道，新鲜粪便放入4 ℃无氧环境中可保存3 d。本研究发现，4 ℃无氧保存线虫卵9 d 后，仍有50%以上的虫卵可用于试验，这极大扩展了EHAs 等试验的适用范围，尤其是对需要在农区、牧区、野外等环境下采集粪便的试验，以及采集成本高、过程困难的试验具有极大帮助。

目前国内外针对氧含量是否对粪便中线虫卵发育有影响的研究较少，对低温条件是否会抑制虫卵发育的研究较多。WAAVP 报道，有研究人员将虫卵厌氧保存方法成功应用于捻转血矛线线虫、蛇形毛圆线虫、奥氏奥斯特线虫等[11]。Bevevridge等[12]在4～10 ℃条件下研究了澳大利亚东部的粪便毛圆线虫卵孵化率是否会受低温影响，结果发现低温降低了蛇形毛圆线虫等虫卵的孵化率，但对透明毛圆线虫卵的孵化率几乎没有影响。陈能桥等[13]在贵州遵义市研究了牛羊消化道线虫卵在-3～3 ℃环境下是否会影响发育，结果发现低温对毛圆线虫、捻转血毛线虫、古柏线虫、食道口线虫的虫卵影响较大，在-3～3 ℃环境保存72 h后，有94%的虫卵变性死亡。

不同的温度和保存时限影响消化道线虫卵的孵化率，这与虫卵地理分布、种属差异等有一定的关系[12，14-15]。如贵州遵义市冬季平均气温3 ℃，内蒙古乌兰察布察哈尔右翼后旗冬季平均气温-15.7 ℃，两地线虫卵由于地理分布不同，通过长期的虫卵或幼虫越冬淘汰，后者在4 ℃环境下的生存能力强于前者，因而保存时限也会所不同。低温环境会对线虫卵孵化形成一定的影响，因此低温无氧保存的粪便样品一般不适用于虫种鉴定，如4 ℃保存可能影响捻转血毛线虫的孵化[16]。

本试验结果表明，4 ℃无氧保存新鲜绵羊粪便最长时限为9 d，之后虫卵大量死亡，无法达到长期保存、留样的目的。这可能是因为虫卵长时间处于低温、无氧环境中，虫卵自身营养逐渐消耗，保存粪便用的真空袋残留的微量氧气也消耗殆尽，致使大部分虫卵死亡。但9 d 后导致虫卵孵化率迅速降低的具体因素，是虫卵本身的原因，还是保存条件对其产生了不利影响，有待今后进一步研究。