捻转血矛线虫虫卵体外培养观察

叶勇刚，魏 勇，康润敏，叶建强，肖 璐，曹 冶，谢 晶，于吉峰，李兴玉，潘 梦，戴卓建，林 毅，廖党金

（四川省畜牧科学研究院 动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066）

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus），广泛寄生于牛、羊、鹿和骆驼等反刍动物的皱胃或小肠中。该线虫主要靠吸食宿主血液而生，造成宿主贫血、消瘦，严重可致幼畜尤其羔羊大批死亡，给畜牧业造成巨大的经济损失[1-4]。当前流行的寄生虫病检测方法有虫卵检测、免疫学检测和核酸检测，这些方法对于鉴别诊断捻转血矛线虫病非常重要[5-7]。其中，虫卵检测具有直观、准确、操作简单，能够反映宿主感染程度等优点，是寄生虫病非常经典、有效和常用的方法，如麦氏虫卵检测法、加藤厚涂片法、廖氏虫卵检测法、Mini FlOTAC法等[8-12]，这些方法在检测虫卵时，各有优缺点。由于多数虫卵在外观形态上极为相像，往往只有经验丰富的检验人员能依据虫卵形态进行判定，利用这些检测技术也难以将捻转血矛线虫与消化道其它线虫鉴别开来。另外，Megan等[13-14]报道捻转血矛线虫虫卵能特异性地结合花生凝集素，用此方法能鉴别毛圆科的捻转血矛线虫，但牛羊等反刍动物流行的消化道线虫除毛圆科外，还有夏伯特科等其它与捻转血矛线虫虫卵形态相似的线虫，这在一定程度上也限制了该方法的应用。为此，展开捻转血矛线虫虫卵形态和体外发育研究，不仅能补充捻转血矛线虫虫卵在外界的发育状况知识，而且还能为粪便虫卵检测提供形态学参考，有利于开展捻转血矛线虫病的研究和防控。

1 材料和方法

1.1 捻转血矛线虫虫卵成熟虫卵由凉山半细毛羊和南江黄羊皱胃中分离而来的捻转血矛线虫成虫在体外短暂培养自然排出，非成熟虫卵由捻转血矛线虫成虫子宫剖检而来。

1.2 主要仪器OLYPUS CX41显微镜和MSX2科研级数字摄像系统。

1.3 虫卵的收集和体外培养从凉山半细毛羊和南江黄羊皱胃分离捻转血矛线虫成虫，经生理盐水反复洗淘后，选取10条雌虫于盛有生理盐水的玻璃试管中，36．5℃条件下培养，约经20 h后成虫死亡并用挑虫针挑出虫体，培养液经280×g离心后，小心去掉上清液，剩余液体即为虫卵悬液，重新加入适量生理盐水，于敞口玻璃试管中室温（16℃～29℃）培养，每天观察后小心弃掉上清液并重新补充生理盐水。

1.4 观察及图像测量从开始培养起，每日从虫卵液中吸取适量虫卵于载玻片，在400倍放大下采集虫卵图像，同时对虫卵长和宽进行测量；通过轻轻移动盖玻片，滚动虫卵以观察虫卵各个面是否对称。依据每日连续3次吸取虫卵观测所得数据，统计虫卵每日的发育情况。

2 结果与讨论

捻转血矛线虫虫卵外观多呈短椭圆形，少数见不对称面，约占15．79%（图1），卵壳光滑、薄、双层，虫卵浅灰或黄褐色；虫卵大小：长81．27 μm± 5．59 μm（70．17 μm～97．72 μm），宽54．34 μm± 6．63 μm（42．61 μm～69．33 μm），长宽比1．51 ± 0．14。分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫的虫卵大小差异显著，具有统计学意义（表1）。

图1 不对称的捻转血矛线虫虫卵Fig.1 The asymmetrical eggs of Haemonchus contortus

表1 分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵的外观尺寸Table 1 the length, width and aspect ratio of eggs from Haemonchus contortus parasited in sheeps and goats

由雌性成虫自然排出的成熟虫卵，初期胚胎多呈收缩状态似桑葚，约经10～12 h虫卵超过50%变为桑葚期虫卵，后期逐渐发育经历蝌蚪期、含幼虫期，直至幼虫逸出；非成熟虫卵胚胎充满整个虫卵腔室，后期不发育，具体见图2～5。分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵，在体外发育至各阶段的时间略有差异，50%及以上虫卵发育至蝌蚪期时间大致为3 ～4 d，50%及以上虫卵发育至幼虫期所需时间约6～7 d，虫卵中幼虫逸出时间最早在第6 d，至第9 d幼虫全部逸出（表2）。从虫卵刚逸出的幼虫为1期幼虫，从1期幼虫逐渐发育至3期幼虫，其口器、食道、肠道等器官逐渐清晰，幼虫的尾端均尖细，但无法区别雌雄虫，1期和2期幼虫见图6。

表2 分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵在体外发育至各阶段的时间Table 2 The time that the two eggs from Haemonchus contortus parasited in sheeps and goats needs to develop into different stages in vitro

图2 非成熟捻转血矛线虫虫卵Fig.2 Immature eggs of Haemonchus contortus

图3 桑葚期虫卵Fig.3 The eggs whose embryo like mulberry

图4 蝌蚪期虫卵Fig.4 the eggs whose embryo like tadpole

图5 幼虫期虫卵Fig.5 The eggs whose embryo like snake

图6 捻转血矛线虫1期（左）和2期幼虫（右）Fig.6 The L1 stage larvae (left) and the L2 stage Larvae(right)

捻转血矛线虫虫卵在不同的文献记载中，其大小不尽相同。据孔繁瑶[1]报道捻转血矛线虫虫卵大小为75～95 μm×40～50 μm，蒋学良[15]报道捻转血矛线虫虫卵大小为55～65 μm×3 0～43 μm，赵媛媛[16]记录该线虫虫卵大小为66～82 μm×3 9～46 μm，陈少博等[17]则测得虫卵长71．13 μm±2．69 μm、宽42．68 μm±2．47 μm。而在本研究中，所测捻转血矛线虫虫卵大小为（70．17～97．72 μm）×（42．61～ 69．33 μm），其尺寸均比上述文献报道的要大，而且分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵在长、宽和长宽比上还存在差异显著，具有统计学意义。这也许与不同地域或不同宿主分离的捻转血矛线虫虫卵，以及观察虫卵数量的多少有关。此外，对捻转血矛线虫虫卵的观察还发现少数虫卵存在不对称面，约占虫卵总数的15．79%，在文献中未曾报道。

捻转血矛线虫虫卵自排出虫体后，胚胎细胞会不断发育，约经10 h左右，多数成熟虫卵可见16～32个胚细胞，形似桑葚，为桑葚期虫卵，随后发育直至蝌蚪期和幼虫期，直至幼虫逸出[18-19]。据报道，虫卵在体外20．5℃和26℃时，发育至3期幼虫分别需要204 h和132 h[20]。一般1期幼虫发育至3期幼虫，大致需要2 d，也就是虫卵在这2种温度条件下多数发育至幼虫逸出时间大致为5．5 d和3．5 d。本试验中，虫卵在生理盐水中进行孵化未恒定在一个温度，观察时间集中在5月10～17日，温度范围为16℃～29℃，多数虫卵经3～4 d发育至蝌蚪期并见少数幼虫期虫卵，6～7 d后多数虫卵发育至幼虫期，且第6 d见有1期幼虫逸出，孵化至第9 d，幼虫均从虫卵中逸出，相比文献中记录的虫卵发育速度要慢，说明虫卵在体外发育的速度与温度相关。

本试验同时对分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵进行体外孵化观察，对虫卵发育至各阶段所需时间、虫卵外观尺寸等数据进行分析，不仅丰富了对捻转血矛线虫虫卵体外发育的认知，更能有助于指导基层开展捻转血矛线虫病的虫卵检查和防控。