荧光硅量子点作为叶面光肥提高生菜对光能利用率的机理研究

潘晓琴，李常健，张浩然,3，郑胤建，董日月，李 唯,3，宋世威，杨 暹，刘应亮,3，雷炳富,3*

(1． 华南农业大学材料与能源学院 生物基材料与能源教育部重点实验室/广东省光学农业工程技术研究中心，广东 广州 510642；2． 华南农业大学 园艺学院，广东 广州 510642； 3． 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东 广州 510642；4. 中国农业科学院 都市农业研究所，四川 成都 610213)

1 引 言

光合作用是将太阳能直接转化为三磷酸腺苷(ATP)和生物质等产物形式的化学能的生化过程。植物对光能的利用率高低，直接影响植株的形态构建及其生物积累量，如何综合运用纳米材料、微电子及园艺设施等手段提高植物对光能的利用效率，一直以来备受研究人员的关注，成为相关研究领域的热点和难点。提高植物光能利用率的方法大体上可分为两类：一类通过植物外部环境进行调节，如人工施加补光剂[1]、使用高效LED灯[2]、覆盖转光农膜[3]等方法；另一类是通过植物本身的基因改造进行改善[4-5]。后者虽意义重大但耗时长且风险高，前者研究成果转化效率更快，带来的即时经济效益更高。因此，近年来，基于覆盖转光农膜或喷施叶面光肥用于提高植物对光能利用效率的研究方兴未艾[3,6-7]。

近年来，纳米材料及纳米技术用于植物组织成像、叶面肥、金属离子示踪、生物传感等方面的应用已有不少报道[8-11]。非重金属荧光量子点是一类新型的光致发光纳米材料，具有物化稳定性好、毒性低、发光量子效率高、制备工艺简单等独特的优点，近年来受到人们的广泛关注，已经在生物医学、光电器件、传感器、催化和植物光合作用等领域显示出广泛的应用前景。尤其是，由于它们的毒性低、发光效率高、水溶性好等特性，在植物领域的应用成为一个新的热点问题，包括植物细胞成像、植物栽培、基因表达或作为增强光合作用的介质等，受到了广泛的关注[12-13]。在众多研究的荧光量子点中，荧光碳量子点(Carbon dots, CDs)是在植物应用方面研究的热门材料之一，已有的报道包括在绿豆芽上研究CDs在植物体内的转运[14]、在生菜上研究CDs对光合作用的补光作用等[15]。与碳量子点相比，硅量子点(Silicon quantum dots,SiQDs)的原料丰富，光谱吸收范围宽、低毒且生物相容性好，其光学性质较CDs而言相对稳定，多被用于制成生物探针[16-17]，但在植物种植上的应用则少见报道[18-19]，且SiQDs的转光功能对植物光合作用的影响方式也尚不清楚。

在光合作用过程中，叶绿体光合作用仅能利用可见光范围的光能，具有高选择性。紫外或近紫外光不仅难以被植物利用，甚至会造成植物的氧化损伤从而阻碍植物生长。当植物遭受紫外胁迫时，适当增加光谱中的蓝光含量可以降低植物对紫外光的敏感性，从而减缓胁迫作用[20]。大部分SiQDs能够吸收紫外光并转化为红蓝光，具有改变光环境从而保护和提高植物的光能利用率的潜力。值得注意的是，SiQDs中含有大量的Si元素，而Si元素在一些逆境胁迫下对植物生长同样起着改善的作用，如减轻小麦稻瘟病造成的光合能力降低[21]、缓解干旱胁迫对光合作用的抑制等[22]。因此，将SiQDs作为叶面肥施用，既能利用其光肥功能，又兼备Si元素本身对植物生长的积极作用。

基于上述考虑，本研究选取了一种高分散性、纳米尺寸均一且光学性能稳定的高亮SiQDs，提取模式植物生菜的叶绿体，从能量转移层面上解释了SiQDs提高叶绿体光能转化速率的内在机理，并将SiQDs作为叶面光肥，通过植物工厂内的生菜种植实验，验证了其对生菜种植的增产效应。

2 实 验

2.1 样品制备

参考Gong等的方法制备SiQDs[23]。称取11.6 g柠檬酸钠加入到240 mL纯水中，混合搅拌的同时持续通入氮气20 min。加入60 mL N-氨乙基-γ-氨丙基二甲氧基硅烷(DAMO)，继续通入氮气40 min。将混合液倒入500 mL反应釜中，200 ℃条件下反应12 h。冷却至室温，使用截留量为1 000 u的透析袋透析24 h(平均4～5 h换一次水)，透析袋中液体即为目标样品液。旋蒸浓缩样品液后取40 mL进行冷冻干燥，计算可得其浓度为40.16 mg·mL-1。

2.2 叶绿体的提取

参考Pan等的方法提取叶绿体(CLP)[8]。先配置蔗糖磷酸缓冲液，包含0.4 mol/L蔗糖、10 mmol/L氯化钾、30 mmol/L磷酸氢二钠和20 mmol/L磷酸二氢钾，配置完毕后将缓冲液置于冰箱中预冷到4 ℃。使用研磨机将生菜叶片破碎，在蔗糖磷酸缓冲液中提取叶绿体，而后用4层纱布将提取液过滤至棕色样品瓶中，得到叶绿体粗提液，全程在黑暗环境下操作并使用冰浴尽量使叶绿体处于4 ℃的条件下。将粗提液在1 000 r·min-1、4 ℃条件下离心3 min，弃底部沉淀取上层液体，再在3 000 r·min-1、4 ℃条件下离心3 min，得底部沉淀叶绿体。将所得叶绿体再次分散于蔗糖磷酸缓冲液中，得叶绿体悬浮液。取0.1 mL叶绿体悬浮液分散于4.9 mL无水乙醇中，测其在OD650的吸光值，计算可得其浓度为398.21 mg·L-1。

2.3 样品表征

使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM；型号：JEOL-2010)及Nano Measurer对样品形貌及粒径大小进行表征测量。使用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR；型号：Nicolet 6700)和X射线电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS；型号：Thermo Scientific Escalab 250Xi)对样品进行官能团鉴定。使用荧光光谱仪(型号：Hitachi F-7000)测试样品的激发、发射荧光(Photoluminescence,PL)光谱。使用荧光光谱仪(型号：Edinburgh Instruments FLS 1000)表征样品的荧光寿命及绝对量子效率，测试前将溶液稀释到在最佳激发波长处的吸收值小于0.1即可。使用紫外分光光度计(型号：Hitachi UV-2550)测试样品的紫外-可见吸收光谱。

2.4 希尔反应

希尔反应用于测量光合作用过程中光系统Ⅱ的电子传递速率。使用2,6-二氯酚靛酚(2,6-Dichloropheno-lindopheno,DCPIP)的还原速率来表示。分别配置4 mL浓度为0,10,100, 200 mg·mL-1的SiQDs蔗糖-磷酸缓冲液分散液，再加入4 mL叶绿体悬浮液，4 ℃共处理1 h后分别加入2.0 mL 120 μmol/L DCPIP。使用光强为7.0 mW·cm-2的氙灯照射5 min，每隔1 min记录一次溶液在OD600的吸光值。

2.5 生菜应用

生菜种植：品种为“意大利耐抽薹生菜”，一种散叶不结球类型生菜，购于广东省农科院蔬菜研究所。种植地点为华南农业大学校内广东省光学农业工程技术研究中心的植物工厂。营养液配方为华南农业大学叶菜通用配方，环境温度为20～23 ℃，光源为通用白色LED灯，光照18 h黑暗6 h。光照的同时辅以波长为365 nm的紫外灯光照4 h。

生菜处理：幼苗长至3叶1心时，将幼苗转移到水培架上定植10 d。将样品液配制成浓度为0,5,50,100 mg·L-1的SiQDs水分散液，使用喷瓶将不同浓度的样品液均匀地喷施于生菜叶面上，每组3个重复，每隔2 d处理一次，14 d后采收，测定相关指标。其中，在生菜处理的第11 d，取生菜的第4片叶用于叶绿素荧光(IMAGINE PAM)成像实验，测试快速光饱和曲线，成像实验前对生菜进行暗处理20 min。

2.6 数据处理

采用SPSS 15.0 软件进行数据统计分析，经邓肯多重比较检验对试验数据进行差异显著性分析(P<0.05)，利用Origin 8.0对数据拟合、绘图。

3 结果与讨论

3.1 SiQDs的形貌粒径

如图1所示，所制备的SiQDs具有良好的分散性，呈类球形，尺寸分布均匀。取100个纳米粒子测量其尺寸可知该样品的平均粒径为3.6 nm(见图1插图)。SiQDs的TEM图像说明，柠檬酸钠作为强还原剂，可以在高温高压条件下与DAMO反应，自组装形成纳米粒径小、尺寸分布均匀且高分散性高的SiQDs。

图1 SiQDs的TEM图像(插图为SiQDs尺寸分布图)

3.2 FTIR光谱

图2 SiQDs的FTIR光谱

3.3 PL光谱

将SiQDs液稀释到一定浓度后测其荧光激发发射光谱。如图3所示，该材料在380 nm波长激发下荧光强度最大，最佳发射为450 nm，属于蓝色荧光。随着激发波长的延长，SiQDs的荧光发射强度呈现先升高后下降的趋势，而最佳发射并没有出现红移或蓝移的现象，表明该材料不存在激发依赖效应[15]。结合图4(a)可知，该材料在最佳发射下出现的两个激发峰与其紫外-可见吸收光谱相对应，与大部分碳点的吸收光谱类似[25]。此外，测得该材料的绝对量子效率为64.2%，其荧光发射强度特性为实现良好的转光提供了保障。

图3 SiQDs的激发和发射光谱

3.4 XPS能谱

3.5 SiQDs对叶绿体的影响

植物光合作用发生在叶绿体细胞器上。叶绿体上的光合色素可以吸收红蓝光，而后通过光合作用将吸收的光能转化为化学能并储存在植物组织中[32]。如图5(a)所示，叶绿体光合作用的有效吸收范围为400～720 nm的可见光。本研究制备的SiQDs可以吸收紫外光然后发射蓝光，且材料所发的蓝光正好处于生菜叶绿体光合作用的有效吸收范围内(图5(b))，说明SiQDs可以将生菜叶绿体光合作用无法有效利用的紫外光吸收转换为光合作用能有效利用的蓝光。向SiQDs水分散液中添加不同含量叶绿体悬浮液后，观察其荧光光谱，可以发现，随着叶绿体溶液添加量的增多，SiQDs的荧光发射强度下降，并分别在450 nm及513 nm附近出现2个发射峰(图5(c))，且两个发射峰间的凹陷处正好对应了图5(b)的空白处，说明SiQDs发射的蓝光被叶绿体有效吸收。680nm与730 nm处的两个荧光峰的降低是由体系浓度增大导致的叶绿体聚集产生的荧光猝灭(图5(d))。图5(e)展示的是SiQDs及含有3 mL体积的SiQDs/叶绿体混合液的荧光寿命。拟合计算后可知，加入叶绿体前后SiQDs的荧光寿命分别为13.48 ns和13.46 ns，SiQDs/叶绿体的荧光寿命没有明显缩短(表1)。当荧光体浓度较大或与其他吸光物质共存时，荧光体或其他吸光物质对激发光或发射光的吸收导致荧光减弱但寿命却没有发生变化的现象，称为内滤效应。以上结果表明，叶绿体通过内滤效应吸收了SiQDs发射的蓝光。

图5 (a)叶绿体的紫外-可见吸收光谱图；(b)归一化的叶绿体可见光吸收光谱及SiQDs在365 nm激发下的荧光光谱；(c)添加不同体积叶绿体悬浮液后SiQDs在400 nm激发下的荧光光谱(总体积4 mL，SiQDs浓度500 mg·mL-1)；(d)不同浓度叶绿体在400 nm激发下的荧光光谱；(e)SiQDs及SiQDs/叶绿体在450 nm处监测的荧光寿命曲线；(f)不同浓度SiQDs对叶绿体还原DCPIP的影响(用ΔAbs.来表示DCPIP还原速率)。

表1 SiQDs与SiQDs/CLP荧光寿命的多指数拟合数据

为了验证叶绿素是否将吸收的蓝光用于光合作用，我们设计了实验，通过观察不同浓度SiQDs对叶绿体还原DCPIP的影响规律加以讨论。如图5(f)所示，随着SiQDs浓度的提高，DCPIP的被还原量增多，代表着光合电子传递链上的电子传递速率加快[33]。因此可以认为，叶绿体吸收的蓝光促进了生菜的光合作用。

3.6 SiQDs对生菜生长的影响

如图6所示，喷施不同浓度的SiQDs水分散液后，生菜的干重及鲜重较喷施清水的对照组而言均有显著性提高，其中以浓度为50 mg·L-1的效果最佳。在鲜重方面，浓度为5 mg·L-1的处理组与浓度为50,100 mg·L-1的处理组没有显著性差异，50 mg·L-1的处理组与100 mg·L-1的处理组有显著性差异(图6(a))。而在干重方面，尽管较对照组有了显著性的提高，但100 mg·L-1的处理组与5,50 mg·L-1处理组相比却有显著性下降(图6(b))。表明低浓度SiQDs水分散液喷施处理生菜可以提高生菜的干鲜重，而高浓度处理会抑制这种促进效果。

图6 不同浓度SiQDs处理后生菜的生物量。(a)总鲜重；(b)总干重。

3.7 SiQDs对生菜光合作用的影响

为了弄清楚SiQDs对生菜生长的促进作用是否与光合作用有关，采用快速光饱和曲线进行了表征和计算。如图7所示，随着喷施浓度的提高，电子转移速率也得到了提高。这个趋势与图5(f)一致，且5 mg·L-1的处理组与50 mg·L-1的处理组也没有显著性差异。两者相互印证，初步说明SiQDs对生菜生长的促进作用是与SiQDs转光作用提高光合电子传递速率有关的。对曲线拟合结果进行计算分析得到了表2的数据。由表2可知，较对照组而言，SiQDs处理均提高了生菜的最大光合速率，且随着处理浓度的提高而增大，说明适当浓度SiQDs作为叶面光肥施用，可以提高生菜的最大光合速率。

图7 不同浓度SiQDs处理后生菜的快速光饱和曲线

表2 不同浓度SiQDs处理后生菜的光合特性拟合结果

4 讨 论

荧光硅量子点的光学特性与材料的尺寸、表面官能团及分散性等有关。首先是尺寸对发光的影响。TEM结果、PL光谱的对称性和激发不依赖现象都表明，荧光硅量子点的纳米尺寸均一，光学性质稳定，是开展植物应用的有利条件之一。同时，材料的纳米粒径小于5 nm，也有利于从叶面气孔吸收进入植物体内，从而更好地与叶绿体协同作用提高光能利用率[8,14,25,34]。其次是表面的官能团对荧光强度的影响。本方法制备的SiQDs表面含有丰富的—NH官能团，荧光强度高[35]，绝对量子效率高达64.2%，表明该材料的发光效率高，能有效地将植物光合作用不能有效利用的紫外光转换为能被吸收后用于光合作用的蓝光。最后是材料的分散性。在本试验中，FTIR、XPS和紫外-可见吸收光谱测试3种方法结果相互验证，表明该方法制备的SiQDs表面富含多种亲水性含氧官能团，对分散于水溶液中的材料起到保护壳的作用，是SiQDs具有优异的水分散性的主要原因[26]。

图8 SiQDs促进CLP光合作用示意图

SiQDs具有转光功能。CDs作为补光天线可以通过能量共振转移的方式，将能量传递给叶绿体从而提高叶绿体光合效率[36]。但这种传递方式会受限于供体与受体间的距离，发生条件比较苛刻[37]。在本实验中，如图8所示，SiQDs与叶绿体间的能量传递方式为内滤效应，属于辐射能量传递，不受距离限制[38]。将SiQDs作为叶面光肥应用于生菜种植时，既体现了Si元素本身对光合作用起到的促进作用[39]，又利用了硅点的转光功能，从而促进了生菜的光能利用效率。即便SiQDs没有进入叶片细胞内与叶绿体结合，也能将能量传递给叶绿体。

5 结 论

本文采用水热反应制备了性能优异的SiQDs。其优异的分散性则要得益于表面丰富的含氧官能团。当该量子点与叶绿体共存时，会发生内滤效应，提高叶绿体的电子传递速率。通过生菜种植实验证实了适宜浓度的SiQDs(50 mg·L-1)作为叶面光肥能显著提高生菜的干鲜重含量及最大光合速率。因此，本研究认为，SiQDs利用荧光硅量子点的转光功能及硅元素的独特作用，作为叶面光肥应用于生菜种植是可行且有效的，更具体的生物机理研究尚需要后续开展更为完善的植物应用试验进行验证。