基于亚甲基蓝的近红外荧光探针用于HOCl的特异性检测

姚书帆，尧雨斯，郑武斌，叶晨喆，应 杰，吕光磊，李春霞

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

1 引 言

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是介导多种生物过程的重要信号分子[1-3]。次氯酸(HOCl)/次氯酸盐(-OCl)是一种由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶(MPO)催化作用下产生的ROS[4]。HOCl在机体抵抗病原体的免疫防御中起着至关重要的作用[5]。人们发现，HOCl不仅可以清除先天免疫系统中的病原体和微生物，而且在调节细胞内氧化还原平衡中起着重要作用，并参与多种信号传导过程[4]。尽管如此，越来越多的证据表明过量的HOCl会导致细胞和器官的氧化应激，从而引发很多疾病，例如帕金森病[6]、类风湿性关节炎[7]、肝损伤[8]和癌症等[9]。因此，开发一种可靠、精准以及能够在生理水平条件下检测HOCl的分析方法至关重要。

内源性HOCl具有很高的活性，能与其他生物分子和抗氧化剂迅速反应，给跟踪和分析其在生物体内的生理功能带来了巨大挑战[2,10]。在过去的几十年里，科学家们已经开发了一些检测HOCl的方法，如电分析法、色谱法、化学发光法和荧光分析法[11-14]。其中荧光探针以其简单、快速、高选择性、高灵敏度和实时检测等突出优点，被证明是最有效的非侵入性和原位识别HOCl的方法[15-22]。

近年来已经有一些有机小分子荧光探针被广泛应用于HOCl检测，按发光母核的不同大致可以分为：BODIPY[23-26]、萘酰亚胺[27-28]、罗丹明[20,29]、香豆素[30]等。许多荧光探针能够在体外或在细胞中检测HOCl，但由于发射波长较短，使其在活体中的检测受到了限制[31-36]。与可见光荧光探针相比，近红外(NIR)荧光探针具有一些显著的优势，如较高的组织穿透深度和较低背景荧光等[37-41]。因此，迫切需要开发出具有检测生物体中HOCl的近红外荧光探针，而构建“turn-on”荧光探针是检测HOCl的一种重要策略，其具有高的灵敏度和信噪比。

本文以亚甲基蓝(Methylene blue，MB)[42]为荧光母核，利用其还原形式(RMB)和氧化形式(LMB)之间的荧光变化，设计合成了一种近红外荧光探针MB-1用于HOCl的检测。该探针可在体外特异性检测HOCl，伴随着显著的近红外荧光强度的增强和颜色从无色到蓝色明显的变化，在HOCl的分析检测方面具有良好的应用潜力。

2 实 验

2.1 试剂与仪器

实验过程中使用的所有试剂和溶剂均来自商业供应商(表1)，未经进一步纯化。

表1 药品和溶剂

在乙腈或乙醇(HPLC级)中制备探针MB-1的储备溶液(1 mmol/L)，并进一步用PBS(磷酸钠缓冲液，pH=7.4)稀释至最终浓度(10 μmol/L)。根据文献报道的方法合成活性物种[43]。所用材料包括叔丁基过氧化氢(TBHP)、5%NaOCl溶液、30%H2O2溶液、硝基铁氰化钠(Ⅲ)二水合物(SNP)、2,2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐、超氧化钾(KO2)、3-吗啉代嘧啶盐酸盐和亚铁硫酸盐，在超纯水或二甲基亚砜(DMSO)中制备ROS或活性氮物质(RNS)。自由基(·OH和TBO·)由芬顿反应生成：在H2O2(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制备·OH，在TBHP(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制备TBO·。最后在PBS缓冲溶液中稀释到设定的浓度进行测试。

在F-4600荧光分光光度计上测量了探针在HOCl存在时荧光强度的变化，激发波长λex=620 nm。探针的吸收光谱在UH 5300紫外-可见分光光度计上进行测量。1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)在Bruker AV-400或AV-600 NMR光谱仪上进行测量。使用TOF MS仪器进行高分辨率质谱(HRMS)分析。

2.2 探针的合成步骤

MB-1的合成(图1)：向MB(1.00 g，3.13 mmol，1.0 eq)的10 mL水溶液中加入二氯甲烷(DCM，5 mL)和Na2CO3(1.33 g，12.52 mmol，4.0 eq)。在氮气气氛下，将上述混合溶液于40 ℃持续搅拌。接着，使用注射器将溶于水中的连二亚硫酸钠(10.89 g，12.52 mmol，4.0 eq)直接注入混合溶液中。然后，在氮气气氛下，将反应溶液于40 ℃持续搅拌1 h，直到溶液变为黄色。用冰水浴对溶液进行冷却，然后向里面滴加溶于5 mL二氯甲烷中的双(三氯甲基)碳酸酯(0.56 g，1.88 mmol，0.6 eq)。添加完毕后，在氮气气氛下，将混合物于室温下搅拌2 h。最后，将反应溶液倒入100 mL冰水中，并用DCM进行萃取。通过合并有机相，萃取物用无水硫酸钠干燥后在旋转蒸发仪上蒸发除去溶剂，然后通过柱色谱法纯化得到化合物MB-Cl(白色固体，产率为48.2%；乙酸乙酯/正己烷=1/10)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.42(s，2H)，6.72(s，2H)，6.65(d，J=8.0 Hz，2H)，2.98(s，12H)。

向100 mL的schlenk管中加入化合物MB-Cl(50.0 mg，0.144 mmol)、Na2CO3(61.4 mg，0.576 mmol)、N,N-二甲基苯胺(78.6 mg，0.576 mmol)，加入溶剂二氯甲烷(5.0 mL)。在40 ℃条件下，对反应液进行薄层色谱跟踪直至反应完全。反应结束后，反应液冷却到室温，减压浓缩，柱层析分离提纯得到化合物MB-1(黑色固体，产率为58.3%；乙酸乙酯/石油醚=1/1)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.43(d，J=8.2 Hz，2H)，7.23(d，J=7.5 Hz，2H)，6.75(s，1H)，6.71(s，2H)，6.65(s，4H)，2.92(s，12H)，2.86(s，6H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ=153.7，149.0，147.5，134.3，128.7，128.2，127.2，121.6，113.4，111.3，111.0，41.2，40.7。HR-MS(ESI，m/z): calcd for C25H29N5OS [M+H]+，448.214 3，found 448.212 6。

图1 MB-1的合成路线

2.3 检出限的测定

根据常用的荧光滴定法确定检测限(LOD)。通过收集11次探针(10 μmol/L)在PBS缓冲液中的发射光谱以确认其标准偏差(σ)。然后，根据HOCl在0.0～4.0 μmol/L范围内686 nm处的荧光滴定数值拟合线性回归曲线，并获得曲线的斜率(k)。最后，使用以下公式计算检出限：D=3σ/k。

3 结果与讨论

3.1 探针对HOCl的响应性

如图2，探针MB-1本身基本无荧光，但在HOCl存在条件下，缺电子的酰胺羰基处很容易受到攻击从而断裂生成荧光团MB。基于此，我们认为MB-1具有实时检测HOCl的潜在能力。为进一步研究探针对HOCl的响应特性，我们在室温下的PBS溶液中记录了相应的光谱信号。如图3(b)所示，添加HOCl后，探针在686 nm处显示出显著的荧光发射增强，并且当添加10 μmol/L的HOCl时，探针MB-1的荧光强度增强倍数达到最大，为198倍。接着，使用荧光滴定法测试了探针的检出限(HOC1浓度范围为0.0～4.0 μmol/L)，MB-1的检测限低至8.2 nmol/L(图3(c)、(d))。除此之外，我们还通过吸收滴定方法测得其检测限为62 nmol/L(图3(e)、(f))，远大于8.2 nmol/L，进一步说明荧光检测法比吸收光谱的灵敏度高。此外，与荧光强度变化同步发生的是溶液颜色变化，加入HOCl后，溶液由无色变为显著的蓝色(图2)。因此，该探针可以作为HOCl的“裸眼”指示剂。上述结果表明，MB-1探针对溶液中的HOCl具有较高的敏感性。

图2 MB-1与HOCl反应示意图，插图为探针与HOCl反应前后溶液颜色变化。

图3 (a)在HOCl(10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的紫外-可见吸收光谱；(b)在不同浓度的HOCl(0, 2.5,5.0,7.5,10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的荧光光谱；(c)在PBS缓冲液中用HOCl(0.0～4.0 μmol/L)进行连续滴定，探针MB-1(10 μmol/L)的发射光谱；(d)根据HOCl从0.0～4.0 μmol/L范围内MB-1在686 nm处的荧光强度进行线性回归曲线拟合；(e)在PBS缓冲液中用HOCl(0～10 μmol/L)进行连续滴定，探针MB-1(10 μmol/L)的吸收光谱；(f)根据HOCl从0～10 μmol/L范围内MB-1在665 nm处的吸收值进行线性拟合。PBS(pH=7.4)，λex=620 nm，λem=686 nm。

3.2 探针对HOCl的选择性

图4 在PBS溶液(pH=7.4)中存在各种分析物(100 μmol/L)下探针MB-1(10 μmol/L)在686 nm处的荧光响应。(a)添加不同的ROS/RNS(从A到和H：HOCl；(b)添加各种阴离子(从A到和I：HOCl；(c)添加各种阳离子(从A到和J：HOCl；(d)添加各种氨基酸(从A到O：Pro、Ser、Ala、Gln、Val、Thr、lle、Gly、Tyr、Met、Trp、Phe、Cys、Glu、Lys)和P：HOCl。激发和发射波长(λex/λem)分别为620/686 nm。

3.3 探针的抗干扰能力

生物体内不只含有HOCl，为验证该探针具有应用于生物体的潜力，我们研究了加入其他还原剂(包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖和醛)的情况下探针的抗干扰能力。如图5，高浓度的葡萄糖和醛(0.5 mmol/L)不会干扰探针对HOCl的检测，而由于NAC和GSH能在一定程度上消耗HOCl，随着它们浓度的逐渐增加，探针的荧光发射强度有所降低，但即使在分别存在20 μmol/L NAC和GSH情况下，探针的荧光强度仍比仅存在探针本身时增加了13倍和6倍。此外，不同pH值对探针检测HOCl的影响也是我们要考虑的情况之一。如图6，我们检测了探针MB-1在pH=2～12的PBS溶液中与HOCl(10 μmol/L)反应后的荧光强度。结果表明，在10 μmol/L的HOCl存在下，探针的荧光发射强度在5～11的pH范围内均显示出显著的荧光发射增强。综上所述，探针MB-1在复杂的溶液环境中具有出色的抗干扰能力，表明它具有能够在生理水平上进行HOCl检测的可能。

图5 几种细胞还原剂对MB-1(10 μmol/L)响应HOCl的干扰。(a)NAC；(b)GSH；(c)HCHO；(d)葡萄糖。激发和发射波长(λex/λem)分别为620/686 nm。

图6 在不存在和存在HOCl(10 μmol/L)情况下，pH对MB-1(10 μmol/L)在686 nm处荧光强度的影响。激发和发射波长(λex/λem)分别为620/686 nm。

4 结 论

本文基于亚甲基蓝的结构，设计合成了探针分子MB-1用于HOCl的检测。MB-1对HOCl具有良好的特异性、较低的检测限和较好的抗干扰能力，可以实现微量HOCl的特异性检测。另一方面，本文还提供了一种设计思路：通过调整苯胺对位官能团的取代基可以设计合成一系列对HOCl响应的探针分子。该类探针可为检测病变组织部位的HOCl提供可能。该探针也存在一些不足，如只能在HOCl浓度范围比较窄的区间内进行定量测定以及探针对HOCl的响应时间相对较长等。这些都是我们今后需要改进和完善的问题。