聚能式脉冲超声-HPLC-ELSD测定概念鸡蛋中磷脂酰胆碱

陈兴*，张娟，张军慧

中检集团中原农食产品检测（河南）有限公司（郑州 450000）

卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，狭义上的卵磷脂是指磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）[1-2]。PC是细胞膜的重要组成部分，它具有疏通血管、保护肝脏、调节血糖和健脑益智等作用[3-6]。PC还是一种天然食用乳化剂，现已被广泛用于食品、医药和化工等领域[7-8]。PC的提取原料主要来自禽蛋蛋黄和大豆，其中禽蛋蛋黄中PC含量较高[9]。鸡蛋作为最主要的禽蛋品种，不仅富含蛋白质，还提供人体必需的PC等各种营养素[10-11]。近几年，随着人们对食品安全和健康的要求越来越高，被冠以五谷蛋、土鸡蛋、山鸡蛋等概念鸡蛋也越来越多[12]。概念鸡蛋的问世不仅为消费者提供了更多选择空间，与此同时，概念鸡蛋是否比普通鸡蛋更营养也成了困扰消费者的难题。

目前，文献报道的鸡蛋中PC的提取方法主要有超声波提取法和超临界CO2萃取法[11,13-15]，而采用聚能式脉冲超声提取鸡蛋中PC未见报道。全蛋液包括蛋清和蛋黄，虽然PC主要存在于蛋黄中，但是在日常检测的216批次鸡蛋中，80%以上客户要求检测全蛋液中PC的含量。蛋清中蛋白质含量较高，遇到有机溶剂会变性沉淀，不利于PC的提取。聚能式脉冲超声波提取法不仅能够有效破碎上述沉淀物和细胞，释放PC，而且还可有效防止提取剂发热，减少损失。试验以PC含量为指标，通过单因素试验和响应面优化法，优化了聚能式脉冲超声提取条件，采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定概念鸡蛋中PC的含量。该方法操作简便、快速准确、提取剂用量少、重现性良好，可满足试验要求。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪（配有Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器）：日本岛津公司；BILON-250Y超声波细胞破碎机（总功率250 W）：上海比朗仪器制造有限公司；TDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机（广州市墨菲仪器有限公司）；BT125D电子天平（Sartorius）；DDQ-B01A1打蛋器（小熊电器股份有限公司）。

1.2 试剂与材料

正己烷（色谱纯）：Honeywell；异丙醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；正己烷、异丙醇、醋酸（分析纯）：广州化学试剂厂；去离子水（自制）；磷脂酰胆碱（99%，来源蛋黄）：Sigma。

PC提取剂：量取800 mL正己烷、800 mL异丙醇和100 mL 0.1%醋酸，超声混匀备用[16]。

2 方法

2.1 对照品制备

对照品储备液：精密称取18.2 mg PC于10 mL棕色容量瓶中，用PC提取剂溶解并定容至刻度，浓度为1.80 mg/mL。对照品工作液：用PC提取剂将上述储备液逐级稀释成浓度分别为360，240，120，60和30 mg/L的系列工作液。

2.2 样品制备

预处理：取5颗生鸡蛋，将蛋清和蛋黄并入烧杯后，打散混匀备用。

样品提取：称取1.0 g于50 mL离心管中，准确加入15.0 mL提取剂，置于冰水浴中，超声功率比为40%，全程时间为4.0 min，超声/间隙时间为2/3（s/s），超声提取后过滤上机。

2.3 色谱条件

色谱柱：菲罗门硅胶柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：正己烷-异丙醇-水-乙酸-三乙胺体积比2∶74∶24∶1.5∶0.08。流速：1.0 mL/min。柱温：40 ℃。进样量：20 μL。蒸发光散射检测器漂移管温度：100 ℃。载气（氮气）流速：2.0 L/min。

2.4 工艺优化试验

2.4.1 单因素试验

称取1.0 g混合液，超声总功率为250 W，以PC含量为指标，探讨超声功率比（10%，20%，30%，40%和50%）、全程时间（1，3，5，7和9 min）、单个超声/间隙时间（1/1，2/2，2/3，3/3和3/4 s/s）和液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1 mL/g）对PC含量的影响。

2.4.2 因素水平设计

由单因素试验结果得出影响聚能式脉冲超声提取法的3个主要因素：超声功率比、全程时间和液料比。以单因素优化试验结果为基础，采用响应面优化法进行参数优化，以超声功率比（A）、全程时间（B）和液料比（C）为自变量，PC含量为响应值进行设计，因素水平设计表见表1。

表1 响应面试验因素及水平

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声功率比的影响

全程时间为3 min，超声/间隙时间为2/2（s/s），液料比为15∶1（mL/g），超声功率比分别选择10%，20%，30%，40%和50%进行提取，结果见图1。当超声功率比为30%时，PC含量最大。超声功率比过小，声波的空化效应欠佳，不能有效破碎细胞提取PC；超声功率比过大，产生的空化效应会阻碍超声波的传播，而且容易引起液体飞溅，不利于试验进行。因此选定30%为最佳超声功率比[17]。

图1 超声功率比对磷脂酰胆碱含量的影响

3.1.2 全程时间的影响

超声/间隙时间为2/2（s/s），液料比为15∶1（mL/g），超声功率比为30%，全程时间分别选择1，3，5，7和9 min进行提取，结果见图2。当全程时间为3 min时，PC含量最大。3 min过后PC含量呈降低趋势。可能是随着超声时间的增加，探头升温，容易引起正己烷挥发，进而改变提取剂的极性，影响PC含量。因此最佳全程时间选择3 min。

图2 全程时间对磷脂酰胆碱含量的影响

3.1.3 超声/间隙时间的影响

液料比为15∶1（mL/g），超声功率比为30%，全程时间为3 min，超声/间隙时间分别选择1/1，2/2，2/3，3/3和3/4（s/s）进行提取，结果见图3。当超声/间隙时间为2/3（s/s）时，PC含量效果最好，但整体而言，由于PC增长率＜2.5%，超声/间隙时间的选择对PC含量的影响较小，可能是只要单组超声时间≥1 s，聚能式超声波的空化效应即可有效破碎沉淀物和细胞，实现PC的快速提取。

图3 超声/间隙时间对磷脂酰胆碱含量的影响

3.1.4 液料比的影响

超声功率比为30%，全程时间为3 min，超声/间隙时间为2/2（s/s），液料比分别选择10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1（mL/g）进行提取，结果见图4。随着液料比的不断增加，PC含量呈现先增加后降低趋势，当液料比为15∶1（mL/g）时PC含量达到最大值。当液料比大于15∶1（mL/g）时，提取剂体积增大，单位体积所受到的声波空化效应降低，使得提取率下降；当液料比小于15∶1（mL/g）时，提取剂过少，提取浓度相对较高，PC传质动力不足。因此选定超声提取最佳液料比15∶1（mL/g）[18]。

3.2 响应面法优化提取条件

3.2.1 响应面试验结果与分析

由表1中的响应面试验方案，得到响应面试验设计与结果，见表2。使用Design Expert 7.0软件对表2的试验结果进行分析，得到回归方程方差分析，见表3。由表3可知，整体模型p＜0.001，失拟项p=0.264 3，说明该模型拟合成功[19]。对表2的试验结果进行二次多项式模型拟合，得到回归方程：Y含量=1.91+0.056A+0.070B-0.016C+0.000AB+7.5×10-3AC+5.0×10-3BC-0.073A2-0.096B2-0.063C2（R2=0.979 3）。

图4 液料比对磷脂酰胆碱含量的影响

表2 响应面试验设计与结果

3.2.2 响应曲面分析

对表2中的试验结果进行响应曲面分析，得出两两因素之间对PC含量的影响，结果如图5所示。通过对比表3中各因素p值和对图5进行响应曲面分析，得出3个因素之间对PC含量的影响顺序：全程时间＞超声功率比＞料液比[20]。Design-Expert 7.0软件给出的最佳提取条件为：超声功率比40%，全程时间3.72 min，液料比14.75∶1（mL/g）。在此条件下，PC的理论含量为1.91×104mg/kg。为方便实际操作，修正后的最佳提取条件为：超声功率比40%，全程时间4.0 min，液料比15∶1（mL/g）。做3次平行试验，PC含量为1.93×104mg/kg，与预测值误差仅为1.05%，说明采用该方法获得的提取条件准确可靠。

图5 PC含量因素间的交互作用图

3.3 方法的线性范围、精密度和检出限

将PC的系列标准工作液进行上机测定，以PC峰面积的常用对数为纵坐标（Y），进样质量的常用对数（X）为横坐标作图，求得线性回归方程：Y=1.448X+13.62，线性回归方程相关系数r=0.999 9，可知PC在30～360 mg/L范围内呈现良好线性关系。

准确称取6份“散养鸡蛋”样品，前处理参照“2.2”，通过上机测定，求得相对标准偏差，为2.53%。当取样量为1.0 g、定容体积为15 mL时，检出限为50 mg/kg（信噪比S/N=3）。

3.4 方法的加标回收率和相对标准偏差

选定“散养鸡蛋”进行加标试验，分别添加高、中和低浓度的对照品，每个加标水平均做平行样，测得PC平均加标回收率，为95.8%～103.0%，相对标准偏差为2.70%，具体结果见表4。

表4 加标回收率结果（n=2）

3.5 实际样品测定

PC是鸡蛋中常见的一种营养素，通过对36种概念鸡蛋中PC含量进行测定，结果表明：（1）不同概念鸡蛋中PC含量差别较大；（2）某些概念鸡蛋中PC的含量低于普通鸡蛋。部分数据结果见表5，对照品和部分样品图谱见图6，PC保留时间为9.2 min。

图6 对照品和样品的色谱图

表5 概念鸡蛋中磷脂酰胆碱的含量

4 结论

在单因素试验基础上，确定了显著影响因素及水平；通过Box-Behnken响应面优化法，确定了概念鸡蛋中磷脂酰胆碱的最佳提取条件。该方法针对性强、操作简便、快速准确、提取剂用量少、重现性良好，既可为禽蛋中其他磷脂的方法开发提供参考，也可为类似基质样品中PC的测定提供技术借鉴。通过对市售的36种概念鸡蛋进行测定，明确了各种鸡蛋中磷脂酰胆碱的含量情况，可为消费者选择提供数据参考。