白藜芦醇逆转过氧化氢引起的心肌细胞损伤研究

李玉梅

近年来，冠心病及其所诱发的急性心肌梗死的发病率逐年上升，已经发展成为危害人类生命健康的主要疾病之一[1]。目前，临床上采用的治疗方法并不能完全缓解缺血症状。据报道，心肌细胞损伤是重要的病理基础，心肌细胞损伤会影响心脏正常功能，形成恶性循环，加重疾病的进程[2～4]。

白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种天然非黄酮类的多酚类化合物，别名芪三酚，广泛存在于蓼科植物虎杖、豆科植物花生、葡萄科植物葡萄等多种植物中[5]。白藜芦醇具有多种活性功能，如抗炎、抗菌、抗癌和抗氧化等药理活性，可预防肿瘤、降低血小板凝聚，并预防心血管疾病等[6]。据报道，白藜芦醇对缺血再灌注心肌损伤和糖尿病心肌病变等多种心肌损伤具有明确的保护作用，但过氧化氢引起的心肌损伤有关的研究较少[7～9]。本研究利用过氧化氢构建心肌细胞损伤模型，观察白藜芦醇对过氧化氢(H2O2)引起心肌细胞损伤的保护作用。

1.材料与方法

1.1 细胞与细胞培养 心肌H9C2细胞购自北京北纳创联生物技术研究院。采用含10%胎牛血清(Invitrogen，美国)的DMEM培养液(Hyclone，美国)中培养，并置于5%CO2、37℃细胞培养箱(Thermo，美国)中。实验中所有细胞为对数期的细胞。待细胞汇合度达到90%时，采用0.25%的胰蛋白酶(碧云天，中国)进行消化和传代。

1.2 构建心肌细胞损伤模型 将H2O2原液(Fresenius Kabi，中国)用PBS(索莱宝，中国)配制成浓度为10mM的母液，再用DMEM培养基将母液配制成不同浓度的溶液，并加入每孔中。分组分别为对照组、100μM H2O2组、200μM H2O2组、300μM H2O2组、400μM H2O2组，处理6小时后进行后续实验。

1.3 白藜芦醇处理 白藜芦醇购自美国Sigma公司，溶解于DMSO溶液中，使母液浓度达到100mM。处理前将其溶于DMEM培养液中达到工作液浓度，混匀后使用。用25μM、50μM、100μM白藜芦醇处理损伤的心肌细胞6小时后，用于后续实验。

1.4 MTT实验 心肌H9C2细胞按照2000个/孔的密度接种于96孔板，构建损伤模型及白藜芦醇加药处理后，每孔加入20μl添加MTT溶液，置于37℃培养箱中孵育4小时。4小时后，弃净上清，加入100μl的DMSO溶液，在摇床上晃动3分钟，待结晶物溶解后，置于酶标仪(TECAN，瑞士)中检测吸光度值，波长为490nm。

1.5 实时定量聚合酶链式(PCR)反应 应用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取细胞总RNA，应用14μl RNA、2μl Enzyme mix，4μl 5×RT缓冲液(Takala公司，中国)合将RNA逆转录成cDNA，逆转录反应条件为：42℃与95℃分别反应60分钟与5分钟。应用2×PCR反应混合物10μl，20×SYBR 1μl，cDNA 1μl，引物0.5μl，H2O 7.5μl，进行实时定量PCR，PCR反应条件为：95℃ 10分钟，95℃ 10秒，60℃ 1分钟，循环40次。目的基因BCl2和Bax的相对表达量采用2-△△CT法。

1.6 LDH、MDA、SOD水平检测 取细胞培养液上清，应用乳酸脱氢酶(LDH)含量检测试剂盒(Sigma，美国)，采用二硝基苯肼显色法检测上清中LDH水平；应用丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(碧云天，中国)，采用硫代巴比妥酸法检测MDA水平；应用超氧化物歧化酶(SOD)含量检测试剂盒(碧云天，中国)，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD。所有步骤参照试剂盒说明书。

1.7 统计学方法 所有数据均表示为(均数±标准差)，所有实验结果均重复至少3次，数据均采用Graphpad软件进行处理，两组间比较采用配对t检验。P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 不同浓度H2O2对心肌细胞活性的损伤作用 心肌H9C2细胞给予不同浓度H2O2，分组为对照组、100μM H2O2组、200μM H2O2组、300μM H2O2组、400μM H2O2组，处理6小时后进行MTT实验，检测不同浓度H2O2对心肌细胞活性的损伤作用。结果表明，不同浓度H2O2显著损伤心肌细胞活性，400μM H2O2效果最为显著(见图1)。

图1 不同浓度H2O2降低心肌细胞活性

2.2 白藜芦醇逆转H2O2引起的心肌细胞活性降低 心肌H9C2细胞给予400μM H2O2，并给予不同浓度(25μM、50μM、100μM)白藜芦醇，处理6小时后进行MTT实验，检测白藜芦醇是否能够逆转H2O2引起的心肌细胞活性降低。结果表明，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够提高H2O2引起的心肌细胞活性降低(见图2)。

图2 白藜芦醇提高H2O2引起的心肌细胞活性降低

2.3 白藜芦醇逆转H2O2引起的心肌细胞凋亡 心肌H9C2细胞给予400μM H2O2，并给予不同浓度(25μM、50μM、100μM)白藜芦醇，处理6小时后进行MTT实验，检测白藜芦醇是否能够逆转H2O2引起的心肌细胞凋亡。PCR实验结果表明，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够逆转H2O2引起的Bax基因表达上调，而逆转H2O2引起的BCl2基因表达下调，提示，H2O2能够引起心肌细胞发生凋亡，而25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够抑制H2O2引起的心肌细胞凋亡(图3A和3B)。

2.4 白藜芦醇对心肌细胞分泌LDH、MDA、SOD的影响 心肌H9C2细胞给予400μM H2O2，并给予不同浓度(25μM、50μM、100μM)白藜芦醇，处理6小时后进行MTT实验，检测白藜芦醇是否能够调控心肌细胞分泌LDH、MDA、SOD。结果表明，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够逆转H2O2引起的心肌细胞分泌LDH、MDA，而提高H2O2引起的心肌细胞分泌SOD减少，说明过氧化氢能够诱导心肌细胞氧化损伤，而白藜芦醇能够逆转这种损伤(见图4)。

(A)PCR实验检测Bax基因的表达 (B)PCR实验检测BCl2基因的表达

图4 白藜芦醇调控心肌细胞分泌LDH、MDA、SOD

3.结论

急性心肌梗死作为心血管病最危重的病变之一，患者总体死亡率呈上升趋势，严重危害患者的生命安全，影响了患者的生活质量[10]。急性心梗后缺氧诱导的心肌细胞损伤是导致心脏功能受损的最重要细胞学基础[11,12]。因此，本研究利用过氧化氢构建心肌细胞损伤模型，观察白藜芦醇对过氧化氢(H2O2)引起的心肌细胞损伤的保护作用。

本研究中，MTT实验表明，不同浓度(100μM、200μM、300μM、400μM)H2O2显著损伤心肌细胞活性，400μM H2O2效果最为显著。此外，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够提高H2O2引起的心肌细胞活性降低。PCR实验结果表明，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够逆转H2O2引起的Bax基因表达上调，而逆转H2O2引起的BCl2基因表达下调，提示H2O2能够引起心肌细胞发生凋亡，而25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够抑制H2O2引起的心肌细胞凋亡。试剂盒检测实验表明，25μM、50μM、100μM白藜芦醇能够逆转H2O2引起的心肌细胞分泌LDH、MDA，而提高H2O2引起的心肌细胞分泌SOD减少，说明过氧化氢能够诱导心肌细胞氧化损伤，而白藜芦醇能够逆转这种损伤。

综上所示，白藜芦醇能够逆转过氧化氢引起的心肌细胞损伤，对其产生保护作用，在后续实验中我们将进一步探讨白藜芦醇发挥保护作用的具体机制。